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『PCR实验污染』的解决办法!

更新时间:2017-09-05  |  点击率:2443

  PCR污染是每个实验室都多多少少会遇到的问题。原因在于,PCR是非常灵敏的一项检测,100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增,从而容易出现DNA污染导致的假阳性。那么,怎样远离PCR的污染呢?

 

  图 PCR污染之一瞥

 

  首先,要辨别PCR污染的来源。设立阴阳性对照,有利于检测反应体系各成分的污染情况。尤其是设立空白对照,即包括PCR的全部组分,而不加模板DNA,这对检测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。

 

  在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,则考虑可能为环境污染。环境污染的zui主要原因是DNA溶液的溅出和DNA气溶胶造成的实验区域的污染,这尤其在PCR产物扩增区容易出现。移液器枪头和EP管架是也较常见的污染部位。

 

  如果是环境污染,还可对每个区域进行涂抹采样和核酸提取,以zui终鉴定污染的区域所在。德国Minerva Biolabs公司专门生产有DNA污染监测试剂盒(货号181-0010和182-0010),比较方便使用。

 

 

  对PCR的环境污染,有如下几种治理方法:

 

  1. 用常规消毒液定期在环境中喷雾消毒处理。

 

  2. 稀酸处理法:对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡,使残余DNA脱嘌呤;其缺点是盐酸对皮肤有一定的腐蚀性。

 

  3. 紫外照射法:紫外波长一般选择254/300nm,照射30分钟至2小时。但需要注意的是,UV照射仅对500bp以上长片段有效,对短片段效果不大。

 

  4. 选用商品化的DNA污染祛除剂。我们推荐的是Minerva公司的PCR CleanTM 喷雾剂、湿巾。其1分钟即起效,方便快捷,*,可同时去除DNA和RNA。作用1分钟后,用纸巾擦拭,即可完成对DNA污染的清除。

 

 

  对于PCR反应液的污染,可采取以下方法:

 

  1. DNase I 法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室温反应30min后加热灭活,然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。

 

  2. 内切酶法:选择识别4个碱基的内切酶(如MspI和TaqI等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h后加热灭活进行PCR。

 

  3. 紫外照射法:未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述UV照射法。

 

  4. 尿嘧啶糖苷酶(UNG)法:用dUTP代替dTTP,使PCR产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前,用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含dU的新的PCR产物。

 

  图 UNG法预防污染

 

  总之,灵敏度越高的PCR反应越容易出现PCR污染。采用适当的措施消除污染,可以避免重复实验和浪费试剂,也使得实验结果更加可靠而。

 

  参考资料

 

  唐艳荣,张海云,等。聚合酶链式反应(PCR)中主要污染源及处理方法的分析。农业开发与装备,2017(3):99-100

 

  周荣荣,李超。日照市疾病预防控制中心PCR实验室污染情况调查。 医学检验与临床, 2017,28(5):61-63