支原体PCR检测培养方法检测结果

　　支原体PCR检测培养方法检测结果
　　
　　支原体PCR检测直接培养法
　　
　　原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
　　
　　特点：是目前zui直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
　　
　　缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
　　
　　材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
　　
　　污染是细胞培养的大敌，预防和避免污染是成功培养细胞的关键之一。危机意识要贯彻实验的始终，否则不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
　　
　　支原体PCR检测方法与结果：
　　
　　1，将已检测出有支原体污染的细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
　　
　　2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
　　
　　3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。zui后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
　　
　　4，按照支原体检测试剂盒的说明书进行PCR检测操作，结果如下：
　　
　　4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
　　
　　4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。