支原体qPCR检测试剂盒的操作步骤

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养和器材要保证无菌；在细胞培养中加入适量的抗生素。

如果受到支原体污染时，细胞形态较之无明显变化，极易被忽视，往往直到污染非常严重时才能发现。受污染的细胞膜上可能有几百个支原体，这些支原体竞争营养并释放有毒的代谢产物，严重影响实验结果。

『支原体qPCR检测试剂盒』介绍

德国MB公司生产的支原体qPCR检测试剂盒（均为探针法检测），依据操作步骤的细微差别，

分『经典法』和『一步法』两种。

此两类试剂盒较其他厂家同类产品，具有以下*的优点：

①经典法qPCR试剂盒遵循欧洲药典流程要求

②高特异性，一次检测即可涵盖了所有可能感染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的9种支原体），根据序列一致性，至少可以检测到107种支原体物种。操作简单，易于观察。

（使用MB的试剂盒，下表中列出的支原体物种均为阳性，其他微生物或真核细胞均为阴性，无交叉反应）

 

第1步：样本处理

a.细胞培养上清

 

b. 生物药或需遵循药典的样本

说明：①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。

②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。

建议：样本做DNA抽提处理，实现高灵敏度。

推荐：Venor® Gem Sample Preparation Kit

该DNA抽提试剂盒已经过广泛验证。

第2步：试剂制备

a. 冻干粉溶解

 

b. 反应体系制备

b1) 样品为细胞上清筛查——反应体系制备

 

b2) 样品为生物药——反应体系制备

 

第3步：启动荧光定量PCR仪

 

第4步：结果判别

FAM通道：检测支原体荧光信号。HEX通道：检测内控对照荧光信号。

支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。

支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。

定量需基于Ct值和DNA标准曲线。

Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。