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让细胞告别支原体污染的方法在这里

更新时间:2022-11-09  |  点击率:648

养细胞的小伙伴,最怕遇到的,大概就是细胞污染了。

这细菌和真菌污染好辨别,处理起来虽然麻烦,但也不是毫无办法。相比起来,支原体污染才是防不胜防。

显微镜很难捕捉到它们的身影,与细胞共存在同一培养体系下,还跟细胞抢吃抢喝。可怜弱小又无助的细胞根本不是支原体的对手,只能苟延残喘,状态一代不如一代,导致实验结果出现偏差。

多数情况下,发现细胞疑似支原体污染,直接丢掉然后清理环境即可。但在一些特殊实验,比如:细胞保种、抗体药生产、疫苗生产或是细胞治疗过程中,则需要对细胞例行支原体检测,以确保细胞的纯净。

支原体常规检测法之经典法

这里指的是基于经典法试剂盒:Venor®Gem qEP的检测方法。

关于qPCR大家应该都不陌生:

实时荧光定量PCR

Quantitative Real-time PCR

是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

在支原体经典法检测试剂盒中,无需RNA提取和反转录步骤,样品仅需待检测的细胞上清或是从上清中提取的DNA。

经典法试剂盒:Venor®Gem qEP使用方法

一、样品制备:

①浓缩:当细胞长至90%时,即可收集上清开始检测,可对样品进行适当浓缩。

注:浓缩仅适用于支原体的完整性,避免浓缩前支原体被破坏(如热灭活)。

②稳定:细胞培养样品可能含有丰富的DNA酶,在低温下也能降解支原体DNA。因而推荐进行样品稳定化处理。如果立即进行DNA抽提,则忽略这一步。

③DNA 抽提:大量证据表明,DNA抽提可实现高的灵敏度。DNA抽提有多种方法,但应适合支原体基因组。我们推荐:

Venor®GeM Sample Preparation kits (货号56-1010/-1050/-1200) 适合手动DNA抽提

这些DNA抽提试剂盒已经过大量验证,具体流程参见试剂盒说明书。另外Venor®GeM qEP kit包含的内控DNA对照,也用于验证DNA抽提步骤(内控原理:已知浓度的细胞,包含内部控制DNA序列,该序列不和现有的任何有机体序列同源,对检测的DNA样品干扰极小。在DNA提取前,将该内控细胞和样品一起加入细胞裂解液中,被一起提取出来。和靶点样品一起进行荧光定量PCR实验,内控DNA序列的成功扩增提示靶点DNA的提取成功)。

二、试剂制备与PCR

 

另外,下列仪器已经通过PCR反应验证:

三、结果分析

FAM通道检测支原体荧光信号。依据DNA标准曲线和Ct值定量。具体步骤需参考具体qPCR 仪及软件的功能。我们推荐对包括对照在内的每个样品的扩增曲线进行评估。

Ct<40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。支原体DNA越多,FAM通道信号越高,检测内控对照的HEX通道信号越低。

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