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检测宿主细胞DNA残留的新方法:dPCR技术

更新时间:2023-07-19  |  点击率:413

 

数字PCRDigital PCR)是一种基于单分子水平的PCR扩增技术,旨在准确测量目标分子的数量。相对于传统的定量PCR技术,dPCR通过将PCR反应混合物分割成更小的单元,使每个单元中只有一个目标分子,从而提高了准确性和灵敏度。下面是dPCR技术的详细解释:

 

样品分割:

dPCRPCR反应混合物分割成许多小区域(例如微滴、阵列或芯片孔),使每个区域中只有一个目标分子或没有目标分子。这种样品分割使每个分割区域的PCR反应相互独立,消除了反应竞争的影响。

 

扩增:

在每个样品分割区域中,PCR反应通过加入引物、酶和核苷酸等组分进行扩增。扩增可以使用传统的PCR方法,例如热循环PCRthermal cycling PCR)或滚环扩增(rolling circle amplification)等。关键的一点是,扩增过程中的分子数目是已知的,因为每个分割区域只有一个目标分子或没有目标分子。

 

信号检测:

为了确定每个分割区域是否含有目标分子,通常会使用荧光标记或探针来检测PCR产物的存在与否。荧光信号可以通过荧光显微镜或荧光检测设备进行测量。根据信号的有无,可以将每个分割区域标记为阳性(含有目标分子)或阴性(不含目标分子)。

 

数据分析:

通过统计每个分割区域的阳性和阴性数量,可以计算出目标分子的绝对数量。这通常使用Poisson分布模型进行计算。通过测量多个分割区域的结果,可以获得更准确的目标分子数量,并估计其浓度。

 

dPCR技术的优点:

 

更高的灵敏度:dPCR可以检测极低丰度的目标分子,即使在稀有突变或低拷贝数的情况下也能准确测量。

更高的准确性:由于每个分割区域是独立扩增和检测的,dPCR对抑制物的影响较小,结果更可靠。

更宽的动态范围:dPCR具有较广的线性范围,可以检测从低拷贝数到高拷贝数的目标分子。

无需标准曲线:与定量PCR不同,dPCR不需要依赖外部标准曲线,而是直接计数目标分子的存在与否。

dPCR技术的应用:

 

突变检测:dPCR可以检测罕见突变,用于肿瘤早期诊断、监测病毒突变等。

基因表达分析:dPCR能够准确测量不同基因的表达水平,并检测低丰度的转录变异。

病原体检测:dPCR的高灵敏度和准确性使其成为检测感染病原体的理想工具。

遗传疾病筛查:dPCR可用于检测染色体异常、单基因疾病等遗传疾病的诊断和筛查。

总结:

数字PCRdPCR)是一种利用样品分割和单分子扩增的技术,能够准确测量目标分子的数量。它具有高灵敏度、准确性和宽动态范围等优点,被广泛应用于各个领域的分子生物学研究和诊断中。