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答疑解惑:CCU计数法与CFU定量法如何选择?

更新时间:2023-09-19  |  点击率:281


CCU计数法和CFU定量法,是微生物学和细胞生物学研究中,常用的方法。这两种方法都可以用来测量微生物或细胞数量。具体应该选择使用哪种方法,取决于研究的具体需求、样品类型,以及实验条件的可控性。一般来说,CFU定量法更为常用,它不仅提供数量信息,还提供了关于微生物或细胞活力的信息。

 

在制药和临床领域,支原体定量是采用CCU计数法。即用颜色改变单位(CCU) "对支原体进行定量。该方法主要是将支原体菌液10倍系列稀释,然后接种在含酚红的支原体肉汤培养基中,36°C±1°C 培养714天。使培养基变色的最高菌液稀释度定为1ccu/ml

 

而在制药领域,用PCR/qPCR方法对产品进行支原体检查时,要求检测方法的检测限达到10CFU/mlCFU即菌落形成单位,它代表着支原体在琼脂培养基上的菌落数量,这是另外一种定量法。

 

这两种定量法是否具有可比性?在20202月第4期的《卫生检验杂志》上,一篇名为《支原体菌落形成单位与颜色改变单位定量关系研究》的论文报告了两种方法比较的结果。

 

在该研究中,作者用A8培养基培养解脲支原体(ATCC 3317548小时,用支原体培养基培养人型支原体(ATCC 2311472小时,用SP4培养基培养肺炎支原体(ATCC 293426天,然而观察菌落的生长情况。同时,作者将菌株冻干粉复溶后进行梯度稀释,接种到相应肉汤中。为降低误差,作者对菌液采取了5倍系列稀释,而非10倍。当培养至肉汤颜色不再变化时,最高稀释倍数的菌液浓度即为1ccu/ml,然后根据稀释倍数回算出菌液原液的浓度。

 

在进行CFU计数时,作者发现,典型支原体菌落的直径是15mm~300mm。其中,人型支原体和肺炎支原体的菌落可以肉眼识别,而解脲支原体的菌落直径只有15mm~60mm,需要借助低倍显微镜才能看到并计数。

 

作者重复了10次,结果显示,对于这3株支原体,CCU计数较为稳定,CFU计数则存在一定的波动。对于解脲支原体,CCUCFU二者的计量结果接近,无显著差异;而对于人型支原体和肺炎支原体,CFU计量数值略高于CCU计量数值,有显著差异。

 

由于支原体在肉汤生长比琼脂中要快,因此实际工作中CCU计数更为常见。作者认为,解脲支原体菌落较小,不容易计数,因而标准差较高。10倍稀释对CCU计量的结果会造成一定误差,因为实验中培养基变色的最高稀释度往往并不是能够变色的最高稀释度。降低稀释倍数会减少误差,但是会增加工作量。

 

在该实验中,作者给出了三个菌株10次试验的全部数据,因而可对CCU计数与CFU定量的结果进行比较,明确二者之间的关系。

 

目前,在支原体检查中,越来越多的药厂采用PCRqPCR方法。但该方法用于放行检测时,需要进行方法验证,保证适用性。这是,常用到10CFUTM支原体灵敏度标准品。

 

对于制药领域的支原体检查,欧洲药典规定,以PCR为代表的核酸扩增技术如果要替代培养法,其检测限需至少达到10CFU/ml

 

德国Minerva Biolabs公司(简称MB)提供有欧洲药典规定的9种支原体的10CFU灵敏度标准品,经过精准标定,可用于PCR/qPCR的灵敏度验证。

菌株均来自英国菌种保藏中心(NCTC),具有ATCC编号。

为避免给实验室带来污染,支原体均经过灭活,并且为冻干粉形式,4℃保存,性能稳定。

每种支原体灵敏度标准品提供有CFUGC(基因组拷贝数)的换算数值。