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1+1>2,CRISPR和免疫细胞联合抑制癌细胞,德国MB支原体检测助力科研

更新时间:2023-09-19  |  点击率:275

CRISPR-Cas9是一种常用的基因编辑技术,可以用来改造细胞。被改造的细胞有希望应用于各类疾病的治疗。细胞治疗项目需要通过支原体检测,才有可能被用于临床。德国MB支原体qPCR检测试剂盒,通过欧洲药典和日本药典的方法学验证。

 

表达转基因T细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(CARs)T细胞,已成为一些恶性肿瘤的有效治疗选择。然而,T细胞功能可因慢性刺激而失效。慢性刺激的T细胞可以分化为功能失调状态,其特征是抑制受体(PD-1, LAG-3TIM-3)的表达,增殖和细胞因子的产生减少,转录组和染色质景观改变。以衰竭为特征的T细胞功能障碍已被确定为治疗反应不良的主要原因因此,在包括慢性刺激和强直信号在内的环境中,改善治疗性T细胞的适应性是改善临床反应的一个有希望的策略。

 

基因组工程的进步提供了许多增加T细胞适应性的方法。

 

一种方法是在内源性TCR α常数(TRAC)13的启动子调控下,通过靶向CAR整合或筛选共刺激结构域来确定有利的CAR设计来调节CAR调节/信号转导。

 

第二种方法使用CRISPR-Cas9去除限制持久T细胞功能的基因。从pd -1开始,crispr - cas9介导的抑制受体敲除(KO)已经在临床试验中进行了尝试功能丧失筛选继续指出了增加T细胞适应性的扰动,如Regnase-1/RoquinPtpn2SOCS1,或rasa2

 

作为第三种方法,使用CRISPR激活(CRISPRa)25或开放阅读框(orf)的慢病毒文库进行的功能获得筛选,已经揭示了其可能性,如淋巴蛋白β受体(LTBR)的过表达。然而,这些功能获得筛选方法并没有在原代人T细胞中大规模地与抗原特异性tcrcar结合,而且CRISPRa筛选不能测试合成的基因产物。

 

一种很有前景的方法是通过直接调节转录调节因子或通过合成表面受体(SRs)改变细胞对外部信号的反应来设计TCR-/CAR-T细胞的状态。例如,过表达AP-1/ATF转录因子(tf) c-JunBATF可以改善CAR-T细胞功能。许多研究小组设计了编码开关"受体的合成基因,通过将抑制受体的结构域(PD-1)融合到激活结构域(CD28),将抑制信号转化为激活信号。包括CD200R/CD28TIM-3/CD28在内的一系列合成受体已经被开发出来,但需要系统的分析来了解控制哪些结构域配对有效的规则。更广泛地说,需要一种模块化筛选方法来发现可以与特定tcr /CARs结合的tfsr的组合,以提高功能性能。

 

靶向crispr介导的敲入蛋白(KI)筛选不仅允许在特定位点上测试构建体,而且还克服了汇集的lenti /逆转录病毒筛选方法的几个局限性:病毒重组、半随机整合和可变整合数。研究人员之前开发了一个非病毒池KI (PoKI)平台,并筛选了一个包含36个成员的库,结合ny - eso -1特异性tcr。然而,由于模板切换导致的大量条形码/构建错配阻碍了该方法的扩展,这限制了库的大小和适应性。

 

近日,科研人员开发了模块化池KI筛选(ModPoKI),这是一个使用条形码多顺子适配器模块化构建DNA KI库的适应性平台。相关研究发表在《Cell》上,文章标题为:“Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies"。

 

研究人员构建了两个ModPoKI文库,包含100个转录因子(tf)129个天然和合成表面受体(SRs)。在不同条件下对人类TCR-CAR-T细胞进行了30多次ModPoKI筛选,发现了一种转录因子AP4 (TFAP4)结构,该结构在体外和体内增强了慢性刺激CAR-T细胞的适应性和抗癌功能。ModPoKI的模块化使我们能够生成一个约10,000个成员的TF组合库。BATF-TFAP4多顺反电子结构的非病毒KI增强了适应度。过表达的BATFTFAP4共同占据并调控关键基因靶点,重编程T细胞功能。ModPoKI有助于发现复杂的基因结构来编程细胞功能。总的来说,这些研究强调了大规模ModPoKI筛选是一种强大的方法,可以加速细胞状态的编程,增强持久性和治疗功能。