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用qPCR方法检测支原体的关键点——样品制备

更新时间:2023-11-19  |  点击率:187

qPCR(定量聚合酶链反应)方法在检测细胞样品中的支原体时具有多个优势:

 

高灵敏度和特异性: qPCR能够检测极低浓度的核酸,使其对支原体的早期检测更为敏感。引物的设计可以确保对目标支原体的高度特异性,减少误报和假阳性的可能性。

 

快速性: qPCR是一种高效的方法,通常在几小时内就能完成。这使得可以迅速获取支原体存在的定量信息,为及时采取措施提供了可能。

 

定量能力: 与传统PCR不同,qPCR可以提供关于支原体数量的定量信息,而不仅仅是检测是否存在。这对于评估感染的程度和追踪治疗效果非常重要。

 

自动化和高通量: qPCR可以轻松集成到自动化平台中,实现高通量的样品处理。这使得可以同时处理大量样品,提高检测的效率。

 

实时监测: qPCR是实时监测反应的技术,能够在扩增过程中实时测量核酸的累积量。这有助于确定PCR反应何时进入指数增长阶段,提高结果的准确性。

 

低检测限: qPCR的灵敏度使其能够检测非常低浓度的核酸,即使在样品中支原体数量很少的情况下也能够可靠地检测到。

 

综合来看,qPCR在检测细胞样品中的支原体方面具有高度敏感、定量准确、快速高效等优势,使其成为支原体研究和临床检测中的重要工具。

 

在进行qPCR检测前,需要对样品进行处理。在处理过程中,以下几个关键点需要注意。

 

一般来说,样品和标准品不应长时间放置。这可能会损害标准品的恢复。

使用的反应容器也会对样品DNA提取造成影响,如果没有使用低结合核酸反应管,DNA最终容易粘在表面。

在提取DNA之前,将200µl样品基质在70℃下失活10分钟是很重要的。培养基及其所含的FBSPCR有抑制作用,无法检测到标准品。

对于10cfu标准品,通过DNA提取对样品进行纯化,对于NAT(核酸扩增技术)即传统PCRqPCR的后续扩增具有重要意义。

体积不能偏离标准推荐量。如果改变了浓度因子,则有可能样品基质中不包含任何标准品。

如果出现以上几种可能性,则标准品或样品没有被检测的效果就会被放大。