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PCR实验常用试剂——DNA聚合酶

更新时间:2024-01-28  |  点击率:214

PCR相关实验在现代生命科学研究中发挥着重要作用。在PCR相关实验中,会用到各种酶试剂,这些试剂关系到实验的成功与否。其中,DNA聚合酶在DNA和RNA的操控、合成和分析中都发挥着难以替代的作用,成为科学家们揭示分子生物学奥秘的有力的工具。

本期内容,盘点PCR实验中常用的DNA聚合酶试剂。

DNA聚合酶(DNA Polymerase)参与DNA分子的合成过程。它在细胞中的主要功能是在DNA复制中负责合成新的DNA链。

DNA聚合酶使用DNA模板上的信息,根据碱基互补配对原则(A-T,C-G配对),从5'→3',即从新链的5'端到3'端进行,在新链上加入互补的核苷酸。DNA聚合酶只能在已存在的DNA链上进行合成,因此需要一个起始点,称为引物(primer),来提供3'端的OH基团,该过程一直持续到整个DNA链被复制完成。

除了PCR实验中,在生物体的细胞中,也有DNA聚合酶的参与,例如,帮助DNA损伤修复和维护基因组的完整性。

DNA聚合酶是一类酶的总称,有多种种类,每种都具有不同的特性和应用。


Taq DNA聚合酶

来源

从耐热细菌Thermus aquaticus中分离得到。

特点

耐热性:Taq DNA聚合酶的适宜工作温度通常在70°C至75°C之间。这使得Taq DNA聚合酶非常适合PCR反应,因为PCR需要在每个循环中通过高温步骤来分离DNA链。

5'→3'聚合酶活性 Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性,即它能够在DNA链的5'端到3'端方向上合成新的DNA链。

没有3'→5'外切酶活性 与一些其他DNA聚合酶不同,Taq DNA聚合酶不具备3'→5'外切酶活性,这意味着它缺乏校正能力,容易引入突变。因此,在PCR反应中,Taq DNA聚合酶的错误率相对较高。

DNA模板依赖性:Taq DNA聚合酶对于DNA模板的依赖性较强,需要引物(primer)提供3'端的OH基团,作为新DNA链的起始点。

Pfu DNA聚合酶

来源

从嗜热古细菌Pyrococcus furiosus中分离得到。

特点
高度的3'→5'外切酶活性:
Pfu DNA聚合酶表现出高度的外切酶活性,使得其能够进行校对,纠正PCR反应中可能发生的错误。这有助于提高扩增产物的准确性。

高保真度:由于其强大的外切酶活性,Pfu DNA聚合酶在PCR反应中具有更低的错误率,提供高度保真的DNA合成。

温度适应性:Pfu DNA聚合酶在较高的温度范围内(通常在72°C至75°C)表现出较高的活性,适用于PCR反应的高温步骤。

缺乏5'→3'外切酶活性:与一些其他聚合酶不同,Pfu DNA聚合酶通常不具备5'→3'外切酶活性,因此不会引入额外的5'端修饰。

大肠杆菌DNA聚合酶

来源

从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离得到。

特点
多功能性:
大肠杆菌中有三种不同类型的 DNA 聚合酶,即 DNA 聚合酶 Ⅰ、DNA 聚合酶 Ⅱ 和 DNA 聚合酶 Ⅲ,它们分别简称为 PolⅠ、PolⅡ 和 PolⅢ。PolⅠ 和 PolⅡ 的主要功能是参与 DNA 的修复过程,而 PolⅢ 的功能看来是同 DNA 的复制有关。

基因克隆:大肠杆菌DNA聚合酶在基因克隆中广泛应用,用于合成DNA片段、连接DNA末端,是DNA构建的关键工具之一。

PCR辅助:在PCR实验中,某些大肠杆菌DNA聚合酶的外切酶活性,比如:Klenow片段,可以用于扩增产物末端的修饰,例如A添加(A-tailing)。

低错误率:大肠杆菌DNA聚合酶通常具有相对较低的错误率,这在一些实验中是需要考虑的因素。然而,与一些高保真度的DNA聚合酶相比,其准确性可能较低。


T4 DNA聚合酶

来源

来自噬菌体T4的DNA聚合酶,属于T4 DNA复制和修复机制中的关键酶之一。

特点

5'→3'聚合酶活性:T4 DNA聚合酶主要表现为5'→3'聚合酶活性,即在合成新的DNA链时,从DNA链的5'端到3'端方向进行。

3'→5'外切酶活性:T4 DNA聚合酶还具有3'→5'外切酶活性,能够修剪单链DNA的3'末端。在反向切除DNA片段时非常有用,例如在DNA修复和重组过程中。

缺乏核酸内切酶活性:与一些其他T4 DNA复制酶不同,T4 DNA聚合酶通常不具有核酸内切酶活性,因此不会切割双链DNA。

依赖于引物:T4 DNA聚合酶在DNA合成时需要引物提供3'端的OH基团,因此通常在反应中需要引物的引导。

DNA末端修饰:T4 DNA聚合酶可用于在DNA末端进行修饰,例如通过添加dA(腺嘌呤)或dG(鸟嘌呤)来形成A悬垂末端或G悬垂末端。

好物推荐

PCR实验

德国Minerva Biolabs公司生产的 Taq DNA聚合酶是一种高效的5‘→3’聚合酶,没有3‘→5’外切核酸酶活性。在72℃和pH9的条件下,MB Taq DNA聚合酶达到其高水平的活性,能够在30秒内扩增1 kb DNA。


Taq的活性在室温时被阻断,例如在准备样品时。当温度高于70℃时,Taq聚合酶的抑制被逆转。在94℃2分钟后聚合酶达到活化。MBTaq DNA聚合酶带有10x缓冲液,能获得更大产率和灵敏度,这应符合大多数标准应用。


MB Taq 热启动DNA聚合酶推荐使用/范围:

常规和多重PCR;实时PCR;T/A克隆;生物素或放射性核苷酸进行DNA标记;双链或单链标准DNA测序