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科学的『支原体标准品』使用方法,让检测结果更灵敏

更新时间:2024-04-29  |  点击率:89

《欧洲药典》第2.6.7章(EP 2.6.7)以及《日本药典》第G3章(JP G3),详细描述了如qPCR等方法、基于核酸扩增技术(NAT)的支原体检测。这些药典中指出,如果需要用NAT法替代传统方法,要求显示每毫升样品体积(CFU/ml)10个菌落形成单位的检测,即灵敏度达到10CFU/ml。这种灵敏度验证是方法验证的一条必经之路。

 

然而,由于一些细胞培养实验室、研究机构、生产线不配备符合支原体培养条件的标准化微生物实验室,很难实现在实验室中培养或处理活的、用于灵敏度测试的支原体菌落。10CFU灵敏度标准品(不可逆灭活的支原体)便应运而生。为了保障灭活菌株的使用效果,德国Minerva Biolabs潜心研制,将先进的冻干粉技术用于支原体检测标准品的生产过程中,尽可能保障在运输过程中不破坏其生物活性,能够帮助科研人员实现更高灵敏度的检测验证。

 

产品虽好,但也需要配合科学的使用方法才能事半功倍。本期内容,我们就来一起探讨,支原体检测标准品的科学使用方法。

 

一、标准品的温度平衡

标准品在不同温度下,可能会表现出不同的特性,忽略温度平衡可能会导致实验结果的不稳定性。

因此,在复溶前需对标准品进行温度平衡处理,以降低因温度突变引起的损坏或变性的可能性,使标准品温度逐渐接近溶解时的温度,减少温度变化造成的不良影响,避免基质温度过低导致冻干粉溶解困难,保证标准品在复溶过程的稳定性和活性,提高实验灵敏度。

具体做法是,在复溶前,需要将标准品从2-8℃环境中转移至室温环境下,对其进行温度平衡,待所有成分与室温一致时,才可进行下一步操作。

 

温度平衡好后,将标准品放入低速离心机内,短暂离心,通过旋转,将附着在管壁的冻干粉末甩至瓶底,保障复溶后物质浓度稳定。

 

小心打开标准品离心管,沿管壁向每个离心管中,加入经过室温平衡的待检样品的同款基质1ml室温孵育5分钟。不建议用移液器反复吹打,容易造成试剂的浪费。孵育好后,可以漩涡10,然后再低速离心机内旋转5秒,将管壁的液体甩下去。

 

二、支原体标准品DNA提取与扩增

灭活支原体含有一部分胆固醇和脂质,对核酸扩增实验会造成不同程度的影响。因此,在检测前,需要对支原体标准品进行DNA提取,以纯化标准品中的DNA并去除可能存在的 PCR 抑制物质,从而提高PCR反应的灵敏度和特异性。此外,经过提取的支原体DNA更容易被PCR扩增,因为纯化后的DNA更容易与引物结合,并且不易受到来自样品基质的干扰。推荐使用配套的Venor®GeM Sample Preparation Kit支原体提取试剂盒(货号:56-1010)。

根据提取试剂盒的要求,取适量标准品溶液进行DNA提取,随后再进行正式的qPCR检测实验。

 

三、支原体标准品DNA分装与储存

 

很多实验人员习惯将用不完的标准品试剂,在复溶后进行冷藏或冷冻储存,其实这样的操作会在很大程度上,降低标准品的生物活性,影响检测的灵敏度,主要影响因素有以下几点:

1、降低标准品的生物活性:反复冻融会导致支原体标准品中核酸等分子结构发生变化或损坏,降低了标准品的活性、影响其稳定性。这些变化可能会在标准品的后续使用过程中,导致实验结果出现较大波动,影响实验结果的准确性。

2、污染风险增加:反复冻融会增加标准品接触外界环境的机会,提高了诸如细菌、真菌等微生物污染,或者其他化学物质的潜在的污染风险。

 

因此,为了确保支原体标准品的活性、稳定性和准确性,我们建议,尽量在复溶后将溶液一次性全部用完,以避免反复冻融带来的潜在负面影响。

 

另外需要注意的是,在任何情况下,都不建议将使用前、还未复溶的标准品进行冷冻保存。

相关人员的研究显示,在2-8℃环境中,德国MB公司的冻干粉状态稳定,在有效期内保存得当的情况下均可放心使用,是一种经济实惠又稳健的储存方式。

如果将冻干粉置于-20℃环境下,可能会使水分重新进入粉末中,导致标准品重新溶解。这个过程中,支原体标准品的结构和活性也会受到影响,从而降低其可靠性和有效性。此外,冷冻过程中可能会引起冻融循环,导致支原体标准品稳定性下降,影响其在实验中的使用效果。