dPCR(数字PCR)和qPCR(实时荧光定量PCR)是两种在分子生物学研究中广泛使用的核酸定量技术,它们之间存在一些显著的区别。以下是对这两种技术的详细比较:
一、检测原理
qPCR:
主要使用插入染料(如SYBR Green)或荧光探针(如TaqMan)来监测整个扩增过程。
随着PCR循环的进行,染料或探针的荧光强度逐渐增加,从而可以检测到定量反应的DNA。
qPCR依赖于标准品制备的标准曲线来确定未知样品的浓度,因此是一种相对定量的方法。
dPCR:
将一个样本分成大量的微小反应单元(通常是微滴或微孔),每个单元包含一个或多个拷贝的核酸分子。
每个单元都进行PCR扩增,并检测扩增产物的荧光信号强度。
根据泊松分布原理以及阳性反应单元的比例,可以计算出起始模板DNA的浓度,因此dPCR是一种绝对定量的方法。
二、检测流程
qPCR:
包括DNA提取、配置qPCR反应体系、加入DNA模板、设置反应条件及PCR扩增、读取结果等步骤。
通常需要使用标准品生成标准曲线,以进行未知样品的定量。
dPCR:
检测流程与qPCR类似,但更强调样本的精确分割和反应单元的独立性。
包括DNA提取、浓度检测并稀释、配置PCR反应液、上机检测、PCR扩增和结果判读等步骤。
dPCR的结果判读通常依赖于对每个微小反应单元的荧光信号检测,以及基于泊松分布的统计分析。
三、技术优势与特点
qPCR:
具有高度的敏感性和特异性,能够实现多重反应和自动化检测。
实时荧光检测模式功能强大,具备定性、定量、突变检测等多种功能。
技术成熟,有大量商业化产品可供选择,且价格相对较低。
更适合高通量分析,动态范围宽。
dPCR:
准确度与精密度高,较少受到扩增效率的影响。
绝对定量,不需要标准品或标准曲线,直接计算样品中目的核酸分子的个数。
抗干扰能力强,对抑制剂的抵抗能力高,适用于复杂样本的检测。
在微小差异面前表现优秀,能够鉴别差异小于20%的拷贝数。
四、应用场景
qPCR:
广泛应用于病原体检测、基因表达分析、遗传病诊断等领域。
在高通量筛选和大规模实验中具有优势。
dPCR:
适用于需要高精度和高灵敏度的实验,如稀有突变检测、基因拷贝数变异分析、无创产前检测(NIPT)等。
在复杂样本和抑制剂存在的情况下表现出色。
dPCR和qPCR在检测原理、检测流程、技术优势与应用场景等方面存在显著差异。研究人员应根据实验需求、样本类型和实验条件等因素,选择合适的技术进行核酸定量研究。