细胞培养遇上“隐形微生物”：支原体的故事与应对

一、初识支原体 支原体直径不到0.3 μm，无细胞壁，可穿过常规0.22 μm滤膜。它们黏附细胞表面，争夺营养，分泌代谢物，改变pH，使细胞状态“悄然滑坡"。

二、常见信号

1.       生长放慢：倍增时间延长30–50 %。

2.       形态异常：贴壁细胞拉丝、圆缩；悬浮细胞成团。

3.       代谢偏移：培养液迅速变黄（酸化），但细胞密度并未升高。

4.       转染/病毒产量骤降：外源基因表达效率莫名下降。

三、污染路径

·         液氮罐：冻存管接口处密封不严，支原体随液氮气溶胶进入。

·         移液器：枪头根部残留液膜成为“藏身点"。

·         共用试剂：胰酶、血清反复开盖，气溶胶逐次累积。

·         人体：手套外壁、袖口、手机屏等均可携带。

四、检测方案

1.       常规培养法：支原体肉汤+琼脂，28 ℃培养7 d，观察“煎蛋样"菌落。

2.       荧光染色：Hoechst 33258染色后，高倍镜下见细胞周亮点或丝状荧光。

3.       快速PCR：16S rRNA保守区引物，30 min出结果，灵敏度10 CFU。

4.       实时阻抗：细胞指数曲线异常漂移，可早期预警。

五、清除策略

·         试剂处理：购买经0.1 μm滤膜、γ射线照射的低内毒素血清；胰酶分装一次性使用。

·         环境管理：生物安全柜每月更换HEPA；CO₂培养箱托盘添加专用消毒剂，水位每日检查。

·         设备清洁：移液器每周整体高温灭菌；液氮罐每季度空罐、酒精擦拭内壁，冻存管接口用封口膜二次密封。

·         应急线：轻度污染——Plasmocin™（50 μg/mL）连续处理两周；重度污染——直接丢弃，全面消毒后重新启动。

六、预防清单

1.       一人一盒：个人专用移液枪、枪头盒，减少交叉。

2.       小体积分装：血清、抗生素、胰酶均按单次用量分装，避免反复冻融。

3.       手套勤换：每步操作后更换，杜绝“手套环游"。

4.       定期盲检：每批次培养基随机抽样，PCR检测阴性后再启用。

5.       记录追溯：建立电子台账，试剂批号、使用日期、责任人一目了然，便于回溯。

七、结语 支原体虽小，却能撼动整个实验。与其事后补救，不如把预防做成习惯：规范操作、定期检测、及时丢弃可疑样本。让培养箱成为细胞安心成长的“净土"，数据自然更加稳健可靠。