科学除支不损细胞活性，支原体污染清除剂的操作手册

科学除支不损细胞活性，支原体污染清除剂的操作手册

支原体污染清除剂主要用于细胞培养过程中支原体污染的清除与后续防护。由于不同货号、批次和使用场景存在差异，具体稀释倍数、处理时长和保存条件应以随货说明书为准。  

使用前准备  

收到试剂后应先核对产品名称、货号、规格、批号和有效期。Mynox类试剂通常需低温保存，使用前按说明书要求融化并避免反复冻融。ZellShield一般建议-18℃左右保存，使用前融化分装，现用现取。操作应在生物安全柜或超净台中进行，穿戴实验服、手套，必要时佩戴口罩，避免试剂接触皮肤或吸入气溶胶。  

处理前建议先确认细胞是否确实存在支原体污染，可采用Hoechst荧光染色、支原体PCR或qPCR检测等方法。若污染程度较轻、细胞状态尚可，可尝试清除；若细胞已大量死亡、贴壁差、增殖严重受抑，建议谨慎评估挽救价值，必要时直接丢弃并进行环境消杀，避免污染扩散。  

细胞污染清除的一般流程  

1.贴壁细胞处理  

贴壁细胞可先弃去旧培养基，用PBS轻柔清洗细胞，再加入含清除试剂的新鲜培养基。若采用MynoxGold，应按说明书配制治疗液，使细胞与试剂充分接触，作用结束后换液并进入巩固防护阶段。若采用ZellShield，可在传代后按推荐比例加入培养基中连续处理。处理期间每2–3天换液一次，并根据细胞密度适时传代。  

2.悬浮细胞处理  

悬浮细胞可先离心收集细胞，弃去含支原体的旧培养基，再用含清除试剂的新鲜培养基重悬培养。若说明书要求使用胰酶/EDTA辅助分散细胞，应严格按推荐浓度和时间操作，避免细胞损伤过大。悬浮细胞与试剂接触更充分，但也更容易因处理条件过强而损失，需密切观察细胞活率。  

3.病毒液或生物样本处理  

对于病毒收获液、生物样本等非细胞体系，应优先选择说明书明确支持该用途的产品。Mynox可用于部分病毒液或样本中的支原体清除，但需控制作用时间、血清浓度和终止条件。处理后建议通过支原体PCR/qPCR复检，确认清除效果。  

巩固处理与效果验证  

支原体被清除后，培养体系中可能仍残留支原体核酸，短期内检测可能出现假阳性，因此不建议在刚结束处理时立即下结论。通常应在清除处理后继续传代培养，再使用支原体PCR或qPCR试剂盒复检。若连续检测为阴性，可继续常规培养并定期抽检；若仍为阳性，应检查是否处理浓度不足、换液不及时、环境再次污染，或考虑更换清除方案。  

清除期间建议保留部分原始污染细胞作为对照，便于比较细胞状态和检测效果。处理结束后，也应至少连续传代2–4代并多次复检，确认支原体未复发。  

环境与器具同步处理  

仅处理细胞而不处理环境，容易造成再次污染。超净台、培养箱、移液器、门把手、液氮罐、水浴锅、细胞培养箱水槽等都应纳入清洁范围。可使用Mycoplasma-Off支原体去除喷雾剂或湿巾对实验台面和设备表面进行喷洒或擦拭，作用5–10分钟后再擦拭干净，并保持通风。培养箱内部处理后应充分通风，若设备支持热灭活功能，可按厂家说明使用。培养箱水舱应定期更换无菌水，并按规范添加抑菌试剂。  

储存与分装要求  

支原体清除剂多为无菌溶液或浓缩试剂，应避免污染和反复冻融。未使用时按说明书温度保存，常见保存条件为-18℃至-20℃避光；部分即用型产品需2–8℃保存。开封后建议在生物安全柜内无菌分装，标注日期、批号和用途。配制好的含药培养基应现配现用，避免长时间放置导致活性下降。  

注意事项  

严格按说明书操作：不同产品、不同批次的稀释倍数、作用时间和适用对象可能不同，不能简单套用其他品牌用法。  

避免与常规抗生素混用：部分清除试剂本身含有抗菌成分，若与其他抗生素联用可能影响效果或增加细胞负担，应以说明书为准。  

密切观察细胞状态：清除过程中可能出现细胞生长变慢、贴壁变差或死亡率升高，需根据细胞类型调整处理强度。  

珍贵细胞优先评估风险：对于原代细胞、干细胞、基因编辑细胞株等，清除失败可能导致进一步损失，应提前制定备份和检测计划。  

清除后必须复检：肉眼无法判断支原体是否清除干净，必须使用支原体PCR或qPCR进行验证。  

仅限科研使用：相关产品通常仅限科研或工业研发用途，不得用于临床诊断、治疗或人体相关应用。  

防止交叉污染：污染细胞应单独操作，废液和耗材需经消毒后再丢弃，避免影响其他细胞系。  

建立预防机制：新入库细胞、复苏细胞、外购血清和培养基应定期抽检支原体；长期培养细胞建议每月进行一次常规检测。