细胞支原体污染的注意事项，一定要了解清楚

支原体是细胞培养中常见且隐蔽的污染物，其直径仅0.2-0.3μm，可穿透常规滤膜，且初期无明显肉眼特征（如培养液浑浊、pH骤变），易被忽视，但会导致细胞生长缓慢、形态异常、基因表达紊乱，甚至直接影响实验结果可靠性。针对细胞支原体污染，需重点关注以下7个核心要点：  

一、污染前：预防是关键，从源头阻断风险  

严格把控“入口关”  

细胞来源需可靠：优先从正规细胞库（如ATCC、中国科学院细胞库）获取细胞，接收后第一时间进行支原体检测（不可依赖“外观判断”），确认阴性后再传代培养；  

试剂灭菌要干净：培养基、血清、胰酶等需经0.1μm滤膜过滤（普通0.22μm滤膜无法截留支原体），且避免反复冻融；PBS、培养液等开封后建议短期内使用，存放时密封避光，防止交叉污染。  

规范操作流程，减少人为污染  

实验前需对超净台进行30分钟以上紫外消毒，操作时戴无菌手套并频繁更换，避免手触碰到吸管、培养瓶瓶口等关键部位；  

不同细胞系操作时需更换移液器吸头、培养液，避免“共用耗材”导致交叉污染；若怀疑某细胞可能污染，需最后处理该细胞，且操作后单独消毒超净台。  

环境与耗材双重防护  

定期清洁培养箱：每周用70%乙醇擦拭培养箱内壁、隔板，每月更换培养箱内的水盘（加入含抗生素的无菌水，抑制支原体滋生）；  

选用无支原体耗材：购买标注“无支原体认证”的培养瓶、离心管、吸头，避免使用反复清洗的玻璃耗材（易残留支原体）。  

二、污染中：及时检测+科学处理，避免扩散  

尽早精准检测，避免“隐性延误”  

推荐使用高灵敏度检测方法：常规PCR法（检测支原体特异性基因）、荧光染色法（观察细胞核外是否有蓝色点状荧光）或商业化支原体检测试剂盒，建议每1-2周对培养细胞进行一次抽检，尤其是传代次数多、来源复杂的细胞；  

避免“经验判断误区”：若细胞出现生长速率下降、贴壁能力减弱、形态皱缩（如上皮细胞变梭形），即使培养液清澈，也需优先排查支原体，而非仅归因于“细胞状态差”。  

污染细胞处理：分类处置，防止扩散  

非关键细胞：直接丢弃（用含10%次氯酸钠的溶液浸泡培养瓶30分钟后再处理），避免试图“挽救”导致污染扩散；  

珍贵细胞：若需挽救，可采用支原体清除试剂（如支原体去除剂、抗生素组合，需注意选择对细胞毒性低的产品），处理后连续检测3代以上，确认支原体阴性且细胞形态、功能正常，方可恢复使用；期间需单独隔离培养，避免与其他细胞接触。  

三、污染后：复盘溯源+长期监控，杜绝复发  

追溯污染源头，针对性改进  

排查可能的污染途径：回顾近期操作（如是否使用过未经检测的血清、是否交叉使用过耗材）、环境（如培养箱是否曾维修、超净台是否有气流异常）、人员（如是否有新操作者加入），找到源头后及时调整（如更换血清批次、重新校准超净台）；  

记录污染事件：详细记录污染细胞系、时间、检测结果、处理方式，建立“细胞污染档案”，便于后续追溯和预防。  

建立长期监控体系，形成闭环管理  

定期“全面筛查”：除单批细胞抽检外，每3个月对实验室所有在培养细胞进行一次支原体普查，同时检测培养箱环境、常用试剂（如血清留样），确保无“潜伏污染”；  

人员培训常态化：定期开展细胞培养规范培训，强调支原体污染的危害与防控细节（如滤膜选择、操作手势），避免因操作不规范导致反复污染。