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dPCR概念及操作步骤详解

更新时间:2023-07-28  |  点击率:303

数字聚合酶链反应(Digital PCRdPCR)是一种高度灵敏和准确的核酸检测技术,它通过将目标分子在大量微小反应单元中进行数字化扩增和检测,实现对稀有或低拷贝数目标的可靠定量。本文将详细介绍dPCR技术的原理,包括样本分割、扩增、测定和数据分析的步骤,以帮助读者深入理解这一先进的生物分析技术。

 

引言

聚合酶链反应(PCR)作为一种常用的核酸扩增技术,已在分子生物学、医学诊断和生物工程等领域发挥着重要作用。然而,传统PCR技术在检测低拷贝数目标时存在灵敏度不足、精确度有限等局限性。为了克服这些限制,dPCR技术应运而生。

 

dPCR的基本原理

dPCR的基本原理是将样本中的目标分子均匀地分割成许多微小反应单元,并在每个反应单元中进行PCR扩增。通过对反应单元的阳性和阴性结果进行数字计数,可以确定目标分子的存在与否,从而实现精确定量。

 

dPCR的步骤

a. 样本准备:首先,从样本中提取目标DNARNA,并根据需要进行适当的预处理,例如逆转录反应或DNA纯化等。

 

b. 样本分割:将样本分割成大量微小反应单元,可以使用微滴数字PCR芯片、微流控芯片或数字PCR芯片等分割技术。每个反应单元包含零个或一个目标分子。

 

c. PCR扩增:在每个微小反应单元中进行PCR扩增。由于每个反应单元中仅包含少量目标分子,使得扩增达到饱和状态的概率较小,从而减少了PCR扩增效率对结果的影响。

 

d. 结果测定:通常使用荧光探针、探针水解或荧光染料等方法对PCR产物进行检测。根据产物是否达到荧光检测阈值,可以判定每个反应单元是阳性还是阴性。

 

e. 数据分析:将阳性和阴性结果的数字计数与总反应单元数量相比较,即可得到目标分子的绝对拷贝数,实现对目标分子的精确定量。

 

dPCR技术的优势

a. 高灵敏度:dPCR可以检测稀有或低拷贝数目标,比传统PCR技术更加敏感。

 

b. 高准确性:由于数字化的特性,dPCR消除了PCR扩增效率的影响,提供更加准确和可靠的定量结果。

 

c. 抗抑制性强:dPCR在复杂样本中的表现优秀,对样本中存在的抑制物质较为抗拒。

 

d. 可重复性好:数字化的dPCR技术具有出色的可重复性,可以在不同实验室和不同时间重现相同的结果。

 

结论

数字聚合酶链反应(dPCR)作为一种高度精确的核酸定量技术,已经在许多领域展现出巨大的潜力和广泛的应用前景。通过样本分割、PCR扩增、结果测定和数据分析等步骤,dPCR能够实现对稀有或低拷贝数目标的可靠定量,为基础研究、临床诊断和生物工程等领域的科学研究和技术应用提供了强有力的支持。随着技术的不断发展,相信dPCR将在未来发挥越来越重要的作用,推动生物科学领域的进步和创新。