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核酸检测技术——LAMP VS qPCR

更新时间:2023-08-13  |  点击率:317

核酸检测

核酸检测技术是一种用于检测、识别和分析DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)分子的方法,广泛应用于医学诊断、疾病监测、基因研究、环境监测等领域。核酸检测技术可以帮助科学家和医生了解基因组信息、疾病相关的基因变异、病原体的存在等重要信息。

常见的

核酸检测技术

01 PCR

聚合酶链反应(PCR):PCR是一种最常见和常用的核酸检测技术,用于在体外扩增目标DNA片段。通过交替变换温度,PCR在特定引物的引导下,在DNA模板的存在下进行多轮循环扩增,最终产生足够多的目标DNA分子。PCR被广泛应用于基因分型、病原体检测、DNA指纹分析等。

02 qPCR

实时定量聚合酶链反应(qPCR):qPCR结合了PCR技术和荧光探针技术,能够实时监测反应中扩增产物的积累量。它不仅可以定性地检测目标核酸的存在,还可以定量地测定目标核酸的数量。qPCR在基因表达分析、病毒载量测定等领域广泛应用。

03 RT-PCR

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR):RT-PCR用于将RNA模板逆转录为相应的DNA,然后进行PCR扩增。它常用于研究基因表达、病毒核酸的检测以及细胞外RNA的分析。

04 LAMP

循环介导等温扩增(LAMP):LAMP是一种在等温条件下进行核酸扩增的技术,不需要复杂的温度循环。LAMP适用于迅速、特异性高的核酸检测,常用于病原体检测、环境监测等。

05 核酸杂交

核酸杂交检测(Southern Blot、Northern Blot):核酸杂交是一种通过分子互补性来检测核酸序列的方法。它可以用于检测目标序列的存在、研究基因组结构变异、进行RNA表达定位等。

06 测序技术

核酸序列分析技术(测序技术):核酸序列分析技术如Sanger测序、下一代测序(NGS)等能够快速高效地测定核酸分子的序列,用于研究基因组结构、变异检测、基因功能等。

07 核酸芯片

核酸芯片技术:核酸芯片可以同时检测大量核酸分子的存在。它在基因表达分析、基因检测、病毒检测等领域具有广泛应用。

LAMP技术

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种分子生物学技术,用于在等温条件下快速扩增DNA或RNA分子。与传统的聚合酶链反应(PCR)相比,LAMP技术不需要复杂的温度循环,只需要恒定的温度即可实现核酸的高效扩增。LAMP主要分为以下几个步骤:生产用于反应的起始材料,循环扩增和伴随循环的延伸和再循环。

01 生产用于反应的起始材料:

引物设计:LAMP扩增过程中使用了多个引物,包括两对外部引物(F3和B3)以及两对内部引物(FIP和BIP),以及一个环引物(Loop primer)。这些引物的设计是基于目标DNA或RNA的特定序列,以确保高度特异性的扩增。


02 循环扩增:

生产哑铃状结构的形成外部引物较短(21-24bp),并且在反应混合物中的浓度较低,与模板结合的速度比内部引物慢。向前和向后的内部和外部引物与BstDNA聚合酶(在60-65°C下显示出高链置换活性)相结合,形成哑铃状DNA结构


03 伴随循环的延伸和再循环:

随后的阶段涉及自引模板的指数扩增和链的替换,从而产生双链DNA的混合物。LAMP的最终输出是花椰菜状结构。

与PCR不同,LAMP在单一温度下(通常为60-65℃)进行扩增,因此不需要温度循环。这有助于操作简单且耗时较短。

04 特殊结构的引物:LAMP技术中的引物具有特殊的结构,其中FIP(Forward Inner Primer)由F1c和F2组成,BIP(Backward Inner Primer)由B1c和B2组成。这些引物的结构促使在扩增过程中产生大量的特定结构的产物,从而进一步提高扩增效率。

05 自我启动的扩增过程:LAMP技术通过自我启动的过程在目标核酸序列上进行扩增。一旦引物与目标序列的互补区域匹配,引物的结构促使产物不断生成,形成一个DNA“蘑菇云"状的结构。

06 环结构的形成:LAMP扩增的一个关键特征是环结构的形成。在LAMP扩增过程中,Loop引物在互补区域与目标序列结合,促使产物的循环形成。这种环结构不仅稳定了产物,还使得新的引物不断与目标序列结合,从而实现高效扩增。

07 产物分析:LAMP扩增产物通常通过肉眼可见的方法进行分析,例如使用荧光染料,pH指示剂或者裸眼观察沉淀物等。产物的积累会导致可观察的变化,从而确定扩增是否成功。


LAMP技术与qPCR技术的区别

扩增原理:

LAMP:等温扩增技术,且引物设计与扩增动力学都很复杂。

qPCR:在不同温度下进行的循环性核酸扩增技术,通过荧光信号监测扩增产物的积累,实现定量分析。


温度条件:

LAMP:一个恒定的等温环境(通常在60-65°C),对设备要求较低。

qPCR:qPCR需要多个温度循环,包括变性、退火和延伸阶段,需要精确的温控设备。


引物设计:

LAMP:使用多个引物,包括外部引物、内部引物和环引物。这些引物的设计相对复杂,要求特定的序列和结构。

qPCR:使用少量的引物(通常一对引物),引物设计相对简单,需要特异性和合适的引物序列。


实时监测:

LAMP:产物通常通过肉眼可见的方式来判断,也可以使用荧光染料等进行增强。

qPCR:利用荧光探针或SYBR Green等荧光信号实时监测扩增产物的积累,可以定量分析。

LAMP与qPCR相比有哪些不足?

由于LAMP方法与qPCR方法各自的特点,导致这两种检测手段分别有其不同的适用范围。

与qPCR相比,LAMP有以下不足:

  • 产物结构复杂:LAMP扩增产物呈现出高度分支的簇环结构,这种结构可能对产物的纯化和后续分析造成一些挑战

  • 不适用于大片段扩增:LAMP技术相对适用于短片段的核酸扩增,不太适用于较长片段的扩增,这一点与传统PCR方法不同。

  • 定量困难:LAMP技术的产物数量与起始模板数量之间的线性关系可能较差,因此在定量方面存在一定的局限性。

  • 部分产物难以区分:LAMP反应产物包括多个簇环结构,其中有些结构可能与非特异性产物难以区分,可能对结果解释带来困扰。

LAMP:适用于快速、初步的检测,如一些疾病的早期筛查,野外环境中的检测等。

如:临床中的一些疾病检测试剂盒。

qPCR:在精确定量和定性检测方面表现出色,广泛用于病原体检测、基因表达分析等。

如:支原体qPCR检测试剂盒