如何提高细胞实验成功率？污染控制千万要做好！

细胞污染是生物实验室中常见的问题之一，轻则引起细胞状态改变，降低实验结果的可重复性，重则会直接导致细胞的死亡，影响实验进度。因此，预防细胞污染，是细胞培养成功的关键点之一

如何控制细胞实验过程中的污染？本期内容，为大家提供一些关键的方法和策略。

一、生物污染

细胞的体外生存环境，可以说是“危机四伏"。空气中漂浮着各种肉眼难以捕捉的微生物，稍有不慎，细胞就会被感染。不仅如此，如果实验操作不够规范，还有可能出现细胞交叉污染的情况。

1、细菌污染

细菌是一种原核细胞微生物，一般为微米级别。细胞培养过程中常见的污染菌为大肠杆菌、葡萄球菌、假单胞菌等。

细胞发生细菌污染后，有哪些症状？与其他污染相比，细菌污染在细胞培养过程中“发病"更为迅速，较容易被发现。当细胞出现如下症状时，基本可以断定，细胞发生了细菌污染：

①细胞培养基在短时间内迅速浑浊；

②静置的培养液时不浑浊，但稍加震荡，就有许多浑浊物漂起；

③显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮；

④细胞停止生长、出现大量死亡；

如果细胞不幸遭遇到了细菌污染的侵袭，该如何应对呢？我们建议直接将细胞丢弃，并对培养环境消毒。国际上大多数实验室会使用Mycoplasma-off™喷雾剂（或湿巾），对超净台、培养箱等环境进行消杀。

2、支原体污染

支原体（mycoplasma）是一类没有细胞壁、高度多形性、部分可用人工培养基培养增殖的原核细胞型微生物，大小为0.3微米左右。在细胞培养过程中，显微镜很难捕捉到它们的身影，与细胞竞争营养，影响细胞生长，最终导致实验出现偏差，当细胞出现如下症状时，基本可以断定，细胞发生了支原体污染：

①生长速率缓慢、活力下降、易脱壁；

②细胞形态改变；

③细胞易聚团；

④在显微镜下，可见培养液中产生大量碎片（培养基不浑浊）；

⑤在培养过程中，培养液很快变黄（意味着培养液中有看不见的大量微生物繁殖，营养被消耗）；

由于支原体体型微小，在细胞培养过程中，普通光学显微镜很难观察到，只有在电镜下才能拍到支原体的照片。细胞培养过程中的支原体污染，会大量消耗培养液中的营养。98%会附着在细胞表面，导致细胞生长状态发生异常，甚至引起死亡，最终导致实验数据发生异常。

如果细胞被支原体污染，该如何处理？对与支原体污染的细胞，优先考虑丢掉细胞，重新培养。

①对于非常珍贵的细胞株（不可再得的）国际上使用Mynox® Gold，做4周左右的支原体祛除持续培养实验。

②对于非常珍贵的细胞株或生物样品（无法长期培养的），可使用Mynox®，对细胞做3小时左右的祛除支原体处理，处理完毕，冲洗细胞，将样品放入洁净的培养液中，重新培养或保存即可。

③对于已经进行到中途的细胞实验，如果将培养的大量细胞丢弃，会造成高昂的实验成本损失。对于这样的情况，补救办法如下：在培养液中加入10%的Zell Shield®（一种新型复合抗生素）。按照厂家建议的方法，配合处理细胞，培养4代以上，基本可祛除支原体污染。

④一些做原代培养的实验室，为了预防取原代细胞过程中可能会发生支原体污染，实验人员也可以在培养液中加入10%的Zell Shield®（一种新型复合抗生素），培养4代以上，即可撤掉Zell Shield®，此过程可有效预防支原体污染的发生。

3、真菌污染

真菌是一类具真核和细胞壁的异养生物。真菌可以通过孢子延续种群，典型的营养体为丝状分支结构。可污染细胞培养基的真菌种类繁多，最常见的有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。当细胞出现上述症状时，基本可以断定，细胞发生了真菌污染：

①在细胞培养液中会形成淡黄色或白色的漂浮物，肉眼可见，但培养液在短期内不变混浊；

②显微镜下可以看见细胞之间或是培养液中，有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝；

③多数菌丝在高倍镜下可以观察到链状排列的菌株，而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散落在细胞上及细胞周边生长。

细胞发生真菌污染时，需要将细胞丢弃，并对培养环境消毒，国际上大多数实验室会使用Mycoplasma-off™喷雾剂，对超净台、培养箱等环境进行消杀。

二、加强细胞间管理，是解决细胞污染真正有效的方法

汇总了各大实验室的工作流程：

1、在正式进入细胞间前，需要在缓冲隔离间佩戴好细胞实验室专用的防护用具：口罩、防护服、鞋套等，开始实验前，佩戴好手套。

2、定期使用Mycoplasma-off™喷雾剂（或湿巾），对工作区域消杀（建议半个月一次，但需根据细胞间实际使用频率决定）。

3、每次实验开始前，和实验结束后，用紫外线对细胞间进行照射消毒，实验操作前用酒精或Mycoplasma-off™喷雾剂对操作人员的手套进行喷涂消毒。

4、在水浴锅或培养箱水槽的水中，加入0.5%的Water Shield™，可确保一个月内水源不会变成支原体、真菌或细菌的污染源。

5、如果细胞间内，发生多株细胞的联合的支原体污染情况，建议在做上述1-4的操作的同时，将液氮罐，也用Mycoplasma-off™喷雾剂（或湿巾）进行消杀，并更换洁净的液氮，（液氮罐中冻存的细胞发生支原体污染，也会在液氮中引起污染的的传播）。

上述内容只分析了生物因素污染，在实际培养过程中，可能还会发生物理或化学污染，请自行排除，本文不再赘述。

三、使用高品质的实验试剂，降低细胞污染风险

胎牛血清是细胞培养中常用的培养基补充物，以维持细胞的生长和健康。选择高品质的胎牛血清，可以尽可能降低细胞污染的风险。

高品质的胎牛血清，血源清晰、通过严格的质量检测，并在检测报告上，表明批次、内毒素含量、无菌检测和病原检测情况、蛋白含量等指标，清晰且明确。以科研人常用的Ausbian进口特级胎牛血清为例，澳洲血源，内毒素含量≤3EU/ml，无菌检测和病原检测结果均为“未检出"病毒和细菌，蛋白含量也有注明，品质如何，一目了然！