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如何提高细胞实验成功率?污染控制千万要做好!

更新时间:2023-10-20  |  点击率:207

细胞污染是生物实验室中常见的问题之一,轻则引起细胞状态改变,降低实验结果的可重复性,重则会直接导致细胞的死亡,影响实验进度。因此,预防细胞污染,是细胞培养成功的关键点之一

 

如何控制细胞实验过程中的污染?本期内容,为大家提供一些关键的方法和策略。

 

一、生物污染

细胞的体外生存环境,可以说是“危机四伏"。空气中漂浮着各种肉眼难以捕捉的微生物,稍有不慎,细胞就会被感染。不仅如此,如果实验操作不够规范,还有可能出现细胞交叉污染的情况。

 

1、细菌污染

细菌是一种原核细胞微生物,一般为微米级别。细胞培养过程中常见的污染菌为大肠杆菌、葡萄球菌、假单胞菌等。

 

细胞发生细菌污染后,有哪些症状?与其他污染相比,细菌污染在细胞培养过程中“发病"更为迅速,较容易被发现。当细胞出现如下症状时,基本可以断定,细胞发生了细菌污染:

①细胞培养基在短时间内迅速浑浊;

②静置的培养液时不浑浊,但稍加震荡,就有许多浑浊物漂起;

③显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮;

④细胞停止生长、出现大量死亡;

 

如果细胞不幸遭遇到了细菌污染的侵袭,该如何应对呢?我们建议直接将细胞丢弃,并对培养环境消毒。国际上大多数实验室会使用Mycoplasma-off™喷雾剂(或湿巾),对超净台、培养箱等环境进行消杀。

 

2、支原体污染

支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁、高度多形性、部分可用人工培养基培养增殖的原核细胞型微生物,大小为0.3微米左右。在细胞培养过程中,显微镜很难捕捉到它们的身影,与细胞竞争营养,影响细胞生长,最终导致实验出现偏差,当细胞出现如下症状时,基本可以断定,细胞发生了支原体污染:

①生长速率缓慢、活力下降、易脱壁;

②细胞形态改变;

③细胞易聚团;

④在显微镜下,可见培养液中产生大量碎片(培养基不浑浊);

⑤在培养过程中,培养液很快变黄(意味着培养液中有看不见的大量微生物繁殖,营养被消耗);

由于支原体体型微小,在细胞培养过程中,普通光学显微镜很难观察到,只有在电镜下才能拍到支原体的照片。细胞培养过程中的支原体污染,会大量消耗培养液中的营养。98%会附着在细胞表面,导致细胞生长状态发生异常,甚至引起死亡,最终导致实验数据发生异常。

 

如果细胞被支原体污染,该如何处理?对与支原体污染的细胞,优先考虑丢掉细胞,重新培养。

①对于非常珍贵的细胞株(不可再得的)国际上使用Mynox® Gold,做4周左右的支原体祛除持续培养实验。

②对于非常珍贵的细胞株或生物样品(无法长期培养的),可使用Mynox®对细胞做3小时左右的祛除支原体处理,处理完毕,冲洗细胞,将样品放入洁净的培养液中,重新培养或保存即可。

③对于已经进行到中途的细胞实验,如果将培养的大量细胞丢弃,会造成高昂的实验成本损失。对于这样的情况,补救办法如下:在培养液中加入10%Zell Shield®(一种新型复合抗生素)。按照厂家建议的方法,配合处理细胞,培养4代以上,基本可祛除支原体污染。

④一些做原代培养的实验室,为了预防取原代细胞过程中可能会发生支原体污染,实验人员也可以在培养液中加入10%Zell Shield®(一种新型复合抗生素),培养4代以上,即可撤掉Zell Shield®,此过程可有效预防支原体污染的发生。

 

3、真菌污染

真菌是一类具真核和细胞壁的异养生物。真菌可以通过孢子延续种群,典型的营养体为丝状分支结构。可污染细胞培养基的真菌种类繁多,最常见的有曲霉菌,白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,孢子菌等。当细胞出现上述症状时,基本可以断定,细胞发生了真菌污染:

①在细胞培养液中会形成淡黄色或白色的漂浮物,肉眼可见,但培养液在短期内不变混浊;

②显微镜下可以看见细胞之间或是培养液中,有纵横交错穿行的丝状,树枝状或管状菌丝;

③多数菌丝在高倍镜下可以观察到链状排列的菌株,而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形,散落在细胞上及细胞周边生长。

 

细胞发生真菌污染时,需要将细胞丢弃,并对培养环境消毒,国际上大多数实验室会使用Mycoplasma-off™喷雾剂,对超净台、培养箱等环境进行消杀。

 

、加强细胞间管理,是解决细胞污染真正有效的方法

 

汇总了各大实验室的工作流程:

1、在正式进入细胞间前,需要在缓冲隔离间佩戴好细胞实验室专用的防护用具:口罩、防护服、鞋套等,开始实验前,佩戴好手套。

2、定期使用Mycoplasma-off™喷雾剂(或湿巾),对工作区域消杀(建议半个月一次,但需根据细胞间实际使用频率决定)。

3、每次实验开始前,和实验结束后,用紫外线对细胞间进行照射消毒,实验操作前用酒精或Mycoplasma-off™喷雾剂对操作人员的手套进行喷涂消毒。

4、在水浴锅或培养箱水槽的水中,加入0.5%Water Shield™,可确保一个月内水源不会变成支原体、真菌或细菌的污染源。

5、如果细胞间内,发生多株细胞的联合的支原体污染情况,建议在做上述1-4的操作的同时,将液氮罐,也用Mycoplasma-off™喷雾剂(或湿巾)进行消杀,并更换洁净的液氮,(液氮罐中冻存的细胞发生支原体污染,也会在液氮中引起污染的的传播)。

 

上述内容只分析了生物因素污染,在实际培养过程中,可能还会发生物理或化学污染,请自行排除,本文不再赘述。

 

三、使用高品质的实验试剂,降低细胞污染风险

胎牛血清是细胞培养中常用的培养基补充物,以维持细胞的生长和健康。选择高品质的胎牛血清,可以尽可能降低细胞污染的风险。

高品质的胎牛血清,血源清晰、通过严格的质量检测,并在检测报告上,表明批次、内毒素含量、无菌检测和病原检测情况、蛋白含量等指标,清晰且明确。以科研人常用的Ausbian进口特级胎牛血清为例,澳洲血源,内毒素含量≤3EU/ml,无菌检测和病原检测结果均为“未检出"病毒和细菌,蛋白含量也有注明,品质如何,一目了然!