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为什么不建议用指示细胞培养法来检测支原体?

更新时间:2023-11-05  |  点击率:297

指示细胞培养法又称为指示细胞法、DNA染色法,该方法的实验思路是:

培养指示细胞-样品上清液收集-上清液接种-染色观察结果

 

具体包含以下几个步骤:

 

将供试品接种于指示细胞(无污染的Vero 细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞,供试品应对该细胞生长无影响。下面以Vero细胞为例)中培养后,用特异荧光染料(如Hoechst 33258)染色,支原体中的核酸也可以被着色,因此,如果待检测细胞中含有支原体,那么就会导致指示细胞被感染,进而在细胞膜或培养基等处发现蓝色荧光(支原体附着在细胞膜上,也有可能游离在细胞培养基中)。

 

指示细胞培养:将指示细胞复苏、传代,调整至最佳状态,留出适宜的量备用。

 

样品上清液收集:无抗生素培养基中加入待检测样品后,细胞需至少传一代,然后取细胞已长满且3 天未换液的细胞培养上清液待检。(为了对待检测样品中的支原体进行富集)

 

上清液接种:在制备好的指示细胞培养板中加入一定量的待检细胞培养上清,36°C培养3-5 天。指示细胞培养物至少传代1 次,末次传代培养可用6孔板培养3-5 天。

 

染色观察:吸出培养孔中的培养液,加入固定液,放置5分钟。吸出固定液后进行10min的二次固定,再次吸出固定液,使盖玻片在空气中干燥。加DNA 染料工作液5ml,加盖,室温放置30分钟,漂洗3次,干燥,封片。用荧光显微镜观察。

 

荧光显微镜下可见细胞表面或培养基中,有大小不等、不规则的蓝色荧光着色颗粒,则说明有可能存在支原体污染。

 

对于DNA染色法方法,优缺点很明显的:

优点:

1、适用于一些不易培养的支原体,如猪鼻支原体,分离培养法对该支原体检测并不可靠,但可用DNA染色法准确地检测出来。

2、操作步骤虽然多,但都相对简单

3、灵敏度尚可。

 

缺点:

1、时间较长,从Vero细胞复苏、传代,再到收集上清后再次培养,有时甚至需要十几天时间

2、存在假阳性和假阴性的可能:如一些死亡细胞释放出来的DNA会被染成蓝色,出现假阳性;或是由于荧光过若而出现假阴性使结果出现偏差,因此使用这个方法需要一定的经验。