PCR检测试剂盒：从样本处理到结果分析的关键细节
一、使用前准备：环境、试剂与个人防护
环境要求
选择干净、无尘、无风且已消毒的操作区域，避免交叉污染。
实验台表面需用紫外灯照射30-60分钟灭菌，照射距离保持60-90cm。
试剂准备
储存条件：试剂盒需在-20℃以下避光保存，使用前恢复至室温（避免反复冻融，建议分装后单次使用）。
试剂配制：使用高质量双蒸水（0.22μm滤膜过滤或高压灭菌），按说明书要求配制缓冲液、洗涤液等。
标准品稀释：
标记离心管，用带芯枪头加入45μL稀释液。
逐级稀释标准品，全程冰上操作。
个人防护
穿戴手套、口罩、实验服，必要时佩戴护目镜，防止试剂接触皮肤或吸入。
二、样本处理：提取与纯化核心步骤
样本采集与保存
细胞、组织或培养基样本需2-8℃保存，血液样本需抗凝处理。
避免使用金属部分接触样本，防止核酸降解。
核酸提取
裂解：加入蛋白酶K和裂解液，涡旋振荡后56℃孵育10分钟。
纯化：
加入无水乙醇沉淀核酸，转移至吸附柱中离心弃液。
用洗涤液（如DNA洗涤液）清洗吸附柱，13000rpm离心3分钟以去除残留杂质。
加入洗脱液（如DNA洗脱液）室温放置1分钟后离心，收集核酸溶液。
质量控制
测定核酸浓度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。
避免使用浑浊或沉淀的样本，必要时重新提取。
三、PCR反应体系配置：精准操作避污染
反应体系组成
20μL体系示例：
PCR反应液：16μL（含引物、dNTPs、缓冲液）
TaqDNA聚合酶：2μL
模板DNA：2μL（根据样本浓度调整）
矿物油（可选）：覆盖反应液防止蒸发（有热盖的PCR仪无需使用）。
加样顺序与技巧
使用带芯枪头避免交叉污染，加样后轻柔混匀并短暂离心。
设置对照：
阳性对照：使用已知浓度的标准品或阳性样本。
阴性对照：用双蒸水或无模板缓冲液代替模板DNA。
空白对照：不加入任何试剂，检测环境污染。
反应条件设定
预变性：94-95℃3-5分钟（解开DNA双链）。
循环扩增：
变性：94-95℃30秒
退火：50-60℃30秒（根据引物Tm值调整）
延伸：72℃30-60秒（根据扩增片段长度调整，如1kb/分钟）
循环数：25-40次（通常35次足够扩增至检测限）。
最终延伸：72℃5-10分钟（确保所有片段延伸）。
四、结果分析：荧光信号解读与质量控制
荧光信号检测
使用荧光定量PCR仪读取Ct值（循环阈值），Ct值越小表示初始模板浓度越高。
标准曲线绘制：以阳性对照浓度的对数值为横轴，Ct值为纵轴，计算线性回归方程（R²≥0.99为合格）。
结果判定
定量分析：根据标准曲线计算样本中目标DNA的拷贝数。
定性分析：
阴性对照无Ct值或Ct≥40，阳性对照Ct≤35且扩增曲线呈典型S形。
样本Ct≤40且扩增曲线正常判定为阳性；无Ct或Ct≥40判定为阴性。
异常处理
翘尾现象：复查样本或重新提取核酸，排除实验室污染（如环境样本或阴性对照检测）。
弱阳性扩增：检查试剂有效期、反应条件或重新采样验证。
400-166-8600
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