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支原体污染确实是细胞培养中一个非常头疼的问题，因为它通常没有明显的外观变化，但会严重影响细胞的各项生理功能，导致实验结果不准。
预防支原体污染的专业建议
预防远比处理更重要，核心在于建立一套严格的无菌操作规范和环境监控体系。
1.源头控制：
- 从信誉良好的机构购买经过支原体检测认证的细胞系。
- 新引入的细胞必须隔离培养，并进行支原体检测，确认阴性后才能与其他细胞共用。
- 定期对工作细胞库进行支原体筛查。
2.操作规范：
- 在超净工作台内进行所有操作，确保台面无菌。
- 严格执行个人防护，如佩戴一次性手套和口罩。
- 定期清洁和消毒培养箱、液氮罐、移液器等设备。
- 避免不同细胞系的交叉使用，如更换吸头和培养基。
3.试剂管理：
- 使用无菌的培养基、血清和添加剂。
- 定期检查试剂是否有浑浊、变色等异常。
常用的支原体检测与清除试剂
1.检测试剂：
- PCR检测试剂盒：这是目前常用、灵敏的方法，能快速准确地检测出支原体DNA。
- 荧光染色法：利用DAPI等染料使支原体DNA着色，在荧光显微镜下可观察到。
2.清除试剂：
- 抗生素类：如支原体去除试剂（Mycoplasma Removal Agent, MRA），通常含有特定抗生素组合，能有效杀灭支原体。
- 抗支原体血清：通过免疫动物获得，可特异性中和并清除支原体。
- 其他化学试剂：如某些消毒剂可用于环境和设备的消毒，但不能直接用于细胞培养体系。
为了方便你在实际操作中对照检查，这里帮您整理了一份细胞培养支原体污染防控清单，这样能帮你把这些要点落实到日常工作中。
细胞培养支原体污染防控清单
一、源头控制与细胞管理
- 新细胞引入：新购买或馈赠的细胞，必须先在隔离培养箱中培养。
- 入库检测：所有细胞在建立工作细胞库前，必须进行支原体检测。
- 定期筛查：每3-6个月，对所有正在培养的细胞系进行一次支原体检测。
二、无菌操作规范
- 个人防护：实验开始前，更换干净的实验服，佩戴一次性手套和口罩。
- 台面准备：用75%乙醇擦拭超净工作台面、移液器和将要使用的试剂瓶外壁。
- 避免交叉：不同细胞系操作时，更换吸头、移液管和废液缸，避免交叉污染。
- 及时清理：实验结束后，立即清理台面，用75%乙醇再次消毒。
三、试剂与耗材管理
- 无菌验证：只使用有明确无菌证明的培养基、血清和添加剂。
- 避免污染：试剂分装时，使用无菌操作，避免反复冻融和长时间室温放置。
- 定期检查：检查培养基是否浑浊、变色，血清是否有沉淀或异常。
四、环境与设备维护
- 培养箱清洁：每周用75%乙醇擦拭培养箱内壁和隔板，定期更换水盘。
- 超净台维护：定期清洁和更换超净台的HEPA过滤器。
- 仪器消毒：液氮罐、离心机等设备，按规定进行定期清洁和消毒。
五、污染应急处理
- 隔离与确认：一旦怀疑污染，立即将可疑细胞隔离，并进行支原体检测。
- 环境消毒：如确认污染，需对培养箱、超净台等进行消毒。
- 细胞处理：轻度污染可尝试使用支原体清除试剂；严重污染建议丢弃，避免扩散。
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