维生素测定培养基的试样处理的顺序是怎么样的

　　

　　维生素B12测定用培养基，不含维生素B12，但包含所有其他维生素和必要养分，用于莱士曼乳酸杆菌（ATCC7830）的生长。莱士曼乳酸杆菌（ATCC7830）作为测定用菌，zui早由Capp等人描述（1）并被美国药典和美国分析化学家协会（AOAC）所推荐（2，3）。

　　

　　用已知稀释度的维生素B12标准品，可以制备标准曲线（2，3）。

　　

　　测试菌液的制备是将将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，推荐在37°C孵育24小时，再离心、清洗、重悬于10ml生理盐水中，再通过浊度分析或酸度分析，确定生长反应。

　　

　　用维生素B12的浓度及对应的吸光度制作标准曲线。用标准曲线可确定待测样本中的维生素B12的浓度。

　　

　　维生素测定培养基的操作方法

　　

　　(1)试样处理

　　

　　①皂化：准确称取1～10g试样(含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加入5muO％抗坏血酸、苯并[P]芘标准液2.OOmL，混匀，加10mL氢氧化钾溶液(1+1)，混匀。于沸水浴回流30min，使皂化*。皂化后立即放入冰水中冷却。

　　

　　②提取：将皂化后的试样移入分液漏斗中，用50mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，用约100mL乙mi分两次洗皂化瓶及其残渣，乙mi液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗中。轻轻摇动分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。

　　

　　③洗涤：用约50mL水洗分液漏斗中的乙mi层，用pH试纸检验直至水层不显碱性(初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。

　　

　　④浓缩：将乙mi提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250～300mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙mi冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压并回收乙mi，待瓶中剩下2mL乙mi时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙mi，立即加入2.OOmL乙醇，充分混合，溶解提取物。

　　

　　将乙醇液移入一小塑料离心管中离心5min(5000r/min)。上清液供色谱分析。如果试样中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹于后，再用乙醇重新定容，并记下体积比。