支原体qpcr法检测：样本的处理与DNA提取

支原体qPCR法检测操作过程  

本流程旨在通过实时荧光定量PCR(qPCR)技术，对样本中的支原体（Mycoplasma）DNA进行特异性扩增与检测，以判断样本是否受到支原体污染。整个过程包括样本处理、DNA提取、qPCR反应体系配制、扩增程序运行及结果分析。  

一、实验前准备  

实验室分区管理  

遵循“三区原则”：样本处理区、试剂准备区、扩增与产物分析区，避免交叉污染。  

各区域使用专用移液器、耗材和工作服。  

试剂与仪器准备  

qPCR仪 

离心机、涡旋振荡器、微量移液器  

支原体DNA提取试剂盒 

支原体特异性qPCR检测试剂盒（含引物、探针、dNTPs、Taq酶、缓冲液等）  

无菌无酶PCR管、枪头  

阳性对照（支原体DNA）、阴性对照（无菌水）、内参对照（如18SrRNA，用于检测提取效率）  

引物与探针设计（若使用自建体系）  

靶基因：常用保守序列如16SrRNA基因或P1黏附蛋白基因。  

探针标记：通常为FAM荧光标记，淬灭基团为BHQ1或TAMRA。  

二、样本处理与DNA提取  

样本类型  

细胞培养上清、血清、尿液、拭子样本等。  

DNA提取步骤（以液体样本为例）  

取1mL样本，13,000rpm离心5分钟，弃上清。  

沉淀中加入裂解液（BufferATL）和蛋白酶K，56℃水浴孵育1小时。  

加入乙醇，混匀后转移至DNA纯化柱。  

依次用洗涤液（AW1、AW2）洗涤。  

最后用50–100μL无酶水洗脱DNA，-20℃保存备用。