15分钟出结果！支原体快检试剂盒使用全指南（含避坑要点）
支原体污染是细胞培养中的“隐形杀手”，会导致细胞生长缓慢、功能异常，甚至实验数据无效。支原体快检试剂盒凭借“快速（10-15分钟）、灵敏（检测限≤10CFU/mL）、操作简便”的优势，成为科研实验室日常质控的核心工具。为确保检测结果精准，需严格遵循以下使用须知：
一、检测前：做好3项核心准备（避免基础失误）
1.样本准备：选对样本类型，确保浓度适配
适用样本：仅用于“细胞培养上清液”“细胞裂解液”或“病毒收获液”，不适用全血、组织匀浆等复杂样本（复杂样本中的蛋白、杂质会干扰检测反应）；
样本要求：
细胞上清液：需收集“对数生长期细胞的上清”（细胞汇合度70%-80%，避免细胞凋亡释放的核酸污染），无需离心（轻微沉淀不影响检测，剧烈离心可能丢失支原体）；
样本浓度：若细胞密度过低（＜1×10⁵cells/mL），需先将上清液“5000rpm离心10分钟”，取沉淀用试剂盒配套的“样本稀释液”重悬（提升支原体浓度，避免假阴性）；
禁忌：样本不可用“含抗生素的培养基”（如青霉素、链霉素会抑制支原体活性，导致检测信号减弱），若培养基含抗生素，需更换无抗培养基培养24小时后再取样。
2.试剂准备：检查状态，平衡温度
试剂完整性：打开试剂盒后，确认“检测卡（含反应区）、样本稀释液、阳性对照、阴性对照”4类试剂齐全，且无漏液、变质（如检测卡反应区变色、稀释液浑浊，需立即更换）；
温度平衡：所有试剂需从2-8℃冰箱取出后，在“室温（20-25℃）放置15分钟”再使用（低温试剂会导致反应速率变慢，延长检测时间，甚至出现假阴性）；
避免污染：阳性对照需单独存放（用醒目标签标注），取用时使用专用移液器吸头，避免交叉污染样本或阴性对照（否则会导致假阳性）。
3.环境与工具准备：控制干扰因素
环境要求：在“无风、洁净的超净台或实验台”操作，避免阳光直射（试剂盒中的荧光探针对强光敏感，直射会导致荧光淬灭，影响结果判读）；
工具适配：需准备“100μL微量移液器（精度±2%）”“无菌离心管”“一次性手套”，移液器需提前校准（避免移液体积偏差导致检测误差），手套需全程佩戴（防止手部皮肤脱落的细胞、核酸污染样本）。
二、检测中：严格遵循4步操作流程（每步都有关键细节）
步骤1：样本处理（仅需2分钟，核心是“均匀混合”）
取“100μL待检测样本”加入到“样本稀释管”中，用移液器反复吹吸5次（确保样本与稀释液充分混合，避免局部浓度不均）；
若样本为“细胞裂解液”，需先加入试剂盒配套的“蛋白酶K”（10μL/管），37℃孵育5分钟（降解细胞蛋白，释放支原体核酸，提升检测灵敏度），再加入稀释液。
步骤2：加样反应（关键是“加样量准确，避免溢出”）
用移液器吸取“50μL处理后的样本”，垂直滴加至检测卡的“加样孔”中（不可滴加在反应区，加样量需精准，过多会导致液体溢出污染反应线，过少会导致反应不充分）；
加样后立即计时，室温静置10-15分钟（不可超过20分钟，超时会导致反应线扩散，无法判读结果），期间不可晃动检测卡（晃动会破坏反应区的层析过程）。
步骤3：阳性/阴性对照同步检测（必须做，排除试剂盒问题）
阳性对照：取“100μL阳性对照液”，按“步骤1-2”同步操作（若阳性对照无检测线，说明试剂盒失效，需更换新试剂盒）；
阴性对照：取“100μL阴性对照液”（通常为无支原体的细胞培养基），同步操作（若阴性对照出现检测线，说明存在交叉污染，需重新取样检测）。
步骤4：结果判读（15分钟准时判读，超过时间无效）
判读标准：检测卡含“质控线（C线）”和“检测线（T线）”，仅C线显色为阴性（样本无支原体污染），C线+T线均显色为阳性（样本含支原体），无C线显色为无效（需重新检测）；
特殊情况：若T线显色“微弱但可见”（需在白色背景下观察），判定为“弱阳性”（提示支原体低浓度污染，建议3天后重新取样检测，或更换高灵敏度试剂盒确认）。
三、检测后：做好3项收尾工作（保障后续实验与安全）
1.结果记录：详细标注，便于追溯
记录内容：需填写“检测日期、样本名称（如HeLa细胞第5代上清）、检测时间、结果（阴性/阳性/弱阳性）、操作人员”，若为阳性，需补充“细胞培养条件（如培养基类型、培养温度）”，便于分析污染来源；
保存方式：检测卡需用密封袋封装后，与记录单一起存放（2-8℃可保存7天，用于后续复查或比对）。
2.试剂处理：分类丢弃，避免污染
废弃试剂：阳性对照、样本稀释管、移液器吸头需放入“生物安全垃圾袋”，高温灭菌（121℃，30分钟）后丢弃（支原体有传染性，避免环境扩散）；
剩余试剂：未用完的检测卡需放回原试剂盒，密封后2-8℃保存（避免反复冻融，保质期内使用，过期试剂不可再用）。
3.环境清洁：消除残留，防止交叉污染
实验台面：用“75%乙醇擦拭”（支原体对乙醇敏感，可有效杀灭），超净台需开启紫外灯照射30分钟（消毒台面和空气）；
移液器：若操作中不慎污染，需用“移液器专用消毒湿巾”擦拭枪头推杆和吸头座，避免后续样本污染。
四、避坑指南：5个常见错误及解决办法
假阴性：样本中支原体浓度过低
错误原因：未离心浓缩样本，或样本取自“静止期细胞”（支原体主要存在于对数期细胞上清）；
解决：下次取样前，将细胞传代至对数期（汇合度70%），上清液5000rpm离心10分钟后检测。
假阳性：操作中交叉污染
错误原因：阳性对照与样本共用移液器吸头，或检测卡加样后被阳性样本污染；
解决：阳性对照需单独使用一套移液器和吸头，加样后立即盖上检测卡盖子，避免液体飞溅。
无效结果：加样量不足或检测卡过期
错误原因：加样量＜50μL（反应不充分），或检测卡超过保质期（试剂活性下降）；
解决：严格按说明书控制加样量，使用前核对试剂盒保质期（通常为12个月，开封后3个月内用完）。
结果误判：超时观察或强光下判读
错误原因：超过20分钟判读（T线扩散消失），或在阳光直射下观察（荧光信号被掩盖）；
解决：15分钟准时判读，在白色背景灯或自然光下观察（避免强光）。
试剂变质：未平衡温度直接使用
错误原因：低温试剂直接加样，导致反应区层析受阻；
解决：试剂需室温平衡15分钟，触摸试剂管外壁无冰凉感后再使用。
五、适用范围与局限性：明确使用边界
适用场景：仅用于“科研实验室细胞培养的支原体质控”，不用于临床诊断（如人体支原体检测）；
不适用情况：样本含“高浓度蛋白（如血清浓度＞20%）”“强还原剂（如β-巯基乙醇）”时，会抑制检测反应，需先用“蛋白去除试剂盒”预处理样本后再检测。
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