支原体qpcr法检测过程及方法详解

支原体qpcr法检测过程及方法详解

一、核心检测原理  

以支原体保守基因为靶标，通过特异性引物与荧光探针结合，在实时荧光定量PCR（qPCR）仪中实现扩增与信号监测的同步进行。通过Ct值（阈值循环数）量化样本中支原体核酸含量，Ct值<30为阳性，Ct>40或无扩增为阴性。  

二、全流程操作步骤  

样本采集与预处理  

类型适配：细胞培养上清、血清、培养基、细胞裂解液等样本需-20℃/-80℃冷冻保存，运输时使用干冰/冰袋。  

处理关键：液体样本离心收集菌体沉淀；含DNA酶样本需用专用试剂盒进行DNA提取，避免降解；固体样本需裂解细胞释放核酸。  

核酸提取与质控  

使用磁珠法或柱提法试剂盒提取DNA，通过分光光度计检测浓度（≥50ng/μL）与纯度（A260/A280≈1.8）。  

反应体系构建  

试剂配制：10μL体系含PCR缓冲液、dNTPs、特异性引物（Tm值50-60℃）、Taq酶、模板DNA及无菌水。  

对照设置：阳性对照（已知支原体DNA）、阴性对照（无支原体样本）、空白对照（无模板）。  

qPCR扩增与监测  

程序设定：预变性95℃/3min，循环40次（变性95℃/15s→退火55℃/20s→延伸72℃/40s），末段延伸72℃/5min。  

荧光通道：FAM检测支原体信号，HEX检测内控对照信号，避免假阴性。  

数据分析与报告  

系统自动生成扩增曲线，结合阳性/阴性对照判定结果。报告包含样本Ct值、扩增曲线图、实验参数（仪器型号、试剂批号）及结论，支持电子/纸质版交付。  

三、支原体qpcr法检测技术优势与注意事项  

优势：灵敏度达10²copies/mL，特异性强（避免交叉反应），2-3小时快速出结果，支持批量检测与定量分析。  

注意事项：防止污染（使用无菌操作台、分装试剂）、避免假阳性（灭活样本需结合培养法验证）、确保样本稳定性（避免反复冻融）。