细胞培养支原体污染防控全攻略——从预防到处理的系统化指南
一、支原体污染的危害与识别
隐性威胁：支原体无细胞壁，可穿透0.22μm滤膜，常规抗生素（如青霉素）无效，常导致细胞生长缓慢、形态异常（如“空泡化”）、实验重复性差，甚至基因表达谱改变。
快速检测：
荧光染色法：使用染色，支原体DNA在紫外光下呈“星点状”荧光。
PCR检测：针对支原体16SrRNA基因设计引物（如通用引物），灵敏度达10CFU/mL，3-4小时出结果。
培养法：将细胞上清接种于支原体培养基，28℃培养14天，观察“煎蛋状”菌落或酸碱指示剂变色。
二、预防措施：源头阻断污染
操作规范：
严格执行无菌操作，穿戴无菌手套、口罩，避免说话时飞沫污染。
定期清洁生物安全柜、培养箱，使用75%酒精擦拭台面，紫外线照射30分钟。
避免交叉污染：不同细胞系使用独立培养瓶、移液器，禁止共用培养基或血清。
材料筛选：
选用支原体检测合格的胎牛血清，避免使用来源不明的血清。
培养基、胰蛋白酶等试剂需经0.1μm滤膜过滤，或添加支原体抑制剂。
环境监控：
定期检测实验室空气、操作台表面、培养箱水盘中的支原体含量，建立污染档案。
三、污染处理：精准清除策略
早期污染处理：
若检测到支原体，立即丢弃污染细胞，消毒培养瓶、移液器、生物安全柜。
对未污染细胞进行“支原体清除培养”：添加支原体特异性抗生素，连续培养3-4代后再次检测。
顽固污染处理：
使用“抗生素冲击疗法”：交替使用不同作用机制的抗生素（如四环素类+大环内酯类），避免耐药性产生。
结合物理方法：如高温处理（56℃30分钟）、紫外线照射、过滤除菌等。
替代方案：
若细胞珍贵且无法清除支原体，可考虑使用“支原体清除试剂盒”，或通过有限稀释法筛选未污染细胞亚群。
四、后续监控与质量保证
定期检测：即使处理成功，也需每月对细胞进行支原体检测，持续3-6个月，确保无复发。
记录与追溯：建立细胞培养档案，记录操作人员、试剂批号、检测结果等信息，便于问题追溯。
质量认证：对于科研或生产用细胞，建议通过第三方机构进行支原体检测认证，确保符合国际标准。
五、特殊注意事项
避免过度依赖抗生素：长期使用抗生素可能导致细胞产生耐药性，或掩盖支原体污染症状。
关注细胞状态：支原体污染常伴随细胞生长缓慢、形态异常，需结合显微镜观察与检测结果综合判断。
人员培训：定期对实验室人员进行支原体污染防控培训，提高操作规范性与污染识别能力。
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