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细胞培养实战指南:如何做好细胞实验?

更新时间:2023-08-08  |  点击率:267

细胞是生物体的基本结构和功能单位。

细胞培养是在人工环境下,将细胞种植或培养在培养皿或培养瓶中,提供适当的培养基和条件,使细胞能够在体外持续生长和繁殖的过程。

细胞培养实验中,有一些细节,对于高效地完成实验十分重要。本期内

容,盘点细胞实验“实战"过程中的关键点。


实验前准备

1、明确细胞身份

在实验正式开始前,需要根据实验目的,确定所需的细胞系。不同的细胞系在形态、生理、代谢和功能等方面有很大的差异。选择适合研究目的的细胞系可以增加实验的准确性和可靠性。

选择来源靠谱的细胞系(细胞类型、细胞来源、细胞代数等信息),根据不同细胞来源,寻找相应的细胞培养资料,明确培养基种类、培养物添加量、培养条件(温度、湿度、二氧化碳浓度)等。

2、实验室环境清洁

在细胞实验开始前,需要对细胞培养环境进行清洁消毒甚至是灭菌处理。仪器、培养室墙壁与地面、培养室空间都应采取对应的清洁措施。

3、准备实验材料

选择高品质的实验耗材与试剂,尽可能选择无菌化处理过后的,若非无菌级,则需自行灭菌后才可用于细胞培养。

胎牛血清是许多细胞培养实验中一种重要的添加物。提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物。还能够提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调节它们所结合的物质活力。

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实验过程


细胞复苏

——液氮中取出的细胞,待液氮挥发后,马上将细胞冻存管置于37℃水浴中轻轻摇动使快速融化(尽量控制在2min内,时间过长了可能会影响细胞的状态)。在解冻时,冻存管瓶口尽量控制在水面以上。

——解冻后,将冻存管转移到无菌操作台,75%酒精擦拭冻存管外部。

——将细胞悬液转移至,装有37℃预热的培养基离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟,弃上清。

——重新加入经预热培养基重悬细胞,以适宜密度,一般约为(3~5)×10^5个/ml密度接种到培养器皿(直径10cm)中。放到37℃孵育,第二天显微镜下观察细胞的情况。

细胞传代

——用移液器吸取并丢弃使用过的细胞培养基(不要直接倒掉,避免瓶口残留导致易污染),并用PBS缓慢冲洗细胞2次。

——以直径10cm的培养皿为例,向培养皿中加入500μl胰蛋白酶-EDTA(根据各细胞的使用说明,选择合适的浓度)消化液,轻轻摇动培养皿,使消化液流遍所有细胞表面,放到37 ℃ 孵育(一般2分钟左右即可)。镜下观察,发现胞质回缩、细胞间隙增大,倾斜培养瓶时细胞层能自然流即可终止,此时应加入2-3ml含血清的培养液终止消化(细胞的解离时间标准可能偏差,根据细胞来源确定,有些细胞属于半贴壁,无需胰蛋白酶也可解离)。

——吸取所有培养皿内的液体,沿培养皿底部缓慢吹打,重复该动作2-3次,使所有细胞沿瓶底流下,再轻柔地把细胞吹打成单个悬液(吹打过程中应尽量避免气泡的产生)。

——把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟后弃上清。

——加入培养基重悬成单细胞悬液。按实验所需的细胞量添加到新的培养皿中,将培养皿37 ℃ 孵育,每天观察细胞的贴壁情况。

注意:向培养皿加液体时,建议从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液,以避免搅动细胞层,前后摇晃容器数次,最后移弃冲洗液。若是悬浮细胞传代培养,过程中省消化步骤。

细胞冻存

——按照“细胞传代"中的步骤收集细胞。

——加入细胞冻存液(一般10%DMSO+对应细胞的培养基),重悬细胞,使细胞的终密度为(5~10)×10^5个/ml,移入细胞冻存管中。

——程序降温,更推荐使用程序降温盒。若手动进行降温,冻存的一般程序为降温速度1~2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可将降温速度增加至5℃~10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。


污染控制

1、设备的清洁与灭菌

在开始任何细胞培养实验之前,必须对所有设备、耗材和试剂进行灭菌处理,当然,我们推荐实验人员尽量选择商品化的无菌试剂。

灭菌方法包括高压灭菌、过滤、紫外线照射、乙醇喷洒或擦拭、消毒清洁试剂喷洒或擦拭等。

2、环境的清洁与灭菌

所有细胞培养工作应在无菌和清洁的环境中进行。因此要对实验环境进行清洁与灭菌。

包括实验前对实验空间定期清洁,包括桌面、地面、墙面、生物安全柜操作台等,开始实验前,还应打开生物安全柜中的紫外线灯进行照射灭菌。

除了常规的消毒试剂,这里推荐使用德国Minerva Biolabs的Mycoplasma-off支原体祛除喷雾剂,不仅对支原体起作用,还能高效清除并预防细菌、真菌等污染物。水浴锅、培养箱水槽等环境,可以添加Water Shield™,有效预防水源中的支原体、细菌、真菌、霉菌、孢子的污染。

3、正确处理实验材料

正确处理实验材料,实验操作应符合相关规定、避免交叉污染。包括佩戴适当的个人防护设备,如手套、口罩;及时更换移液器一次性器具等操作。

4、实验室合理布局

在实验过程中,严格遵守实验室中物品摆放准则,以培养箱举例:培养皿摆放密度应合理,宜少不宜多等。

5、定期监测培养物

定期监测培养物,对于及早发现和解决而言,也是一个关键点。这包括在显微镜下检查培养物状态、肉眼观察培养基的形态、颜色等变化等。必要时可以使用PCR技术定期测试微生物污染的存在。