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R2D2和Loqs-PD协同调控DmDcr-2寡聚物的结构机理,PCR-Clean助力分子生物学

更新时间:2023-09-01  |  点击率:265

对于分子生物学实验来说,祛除DNARNA、核酸酶污染十分重要,是保证实验结果稳定的关键因素之一。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由小RNA介导的保守的转录后调控机制。它在真核生物的基因调控、肿瘤进展、抗病毒防御和控制基因组转座因子等多种生物学过程中发挥着重要作用。

在这一途径中,Argonaute (Ago)蛋白,作为rna诱导沉默复合体(RISC)的组成部分,利用其结合的小非编码rna通过互补碱基配对识别靶rna。这些小RNA可以是由短发夹RNA (pre-miRNA)产生的microRNAs (miRNAs),也可以是由双链RNA (dsRNA)产生的小干扰RNA (sirna),它们都是21-25核苷酸(nt)双链,在5 '端有磷酸,在3 '端有一个2-nt悬垂末端,羟基末端在5 '端。

在哺乳动物中,miRNAsiRNA由相同的RNase-IIIDicer产生,而在果蝇中,它们通常不仅由不同的Dicer (DmDcr-1DmDcr-2)产生,而且分别被分类为功能不同的Argonaute蛋白,如DmAgo1DmAgo2

DicerRNase-III酶家族的一员,在真核生物中高度保守。它由多个结构域组成,包括nDExD/H解旋酶(helicase)结构域、cap结构域(Platform结构域和PAZ结构域)、具有两个RNase-III结构域的核心区和c端双链rna结合结构域(dsRBD)。这些结构域的排列和协作对于确定RNase iii切割的RNA分子的精确长度和结构特征至关重要。HsDicer (Human Dicer)DmDcr-1中的解旋酶结构域对dsrna结合的亲和力较低,缺乏水解ATP的能力。因此,它们的主要底物仅限于短发夹状的pre-miRNA。相比之下,DmDcr-2的解旋酶结构域不同于HsDicerDmDcr-1,因为它可以高亲和力地与dsRNA结合,并促进ATP水解,将dsRNA底物转运到RNA加工中心。

当小RNA双工前体被Dicer蛋白加工时,由多个dsRBDs组成的辅因子dsrna结合蛋白(dsRBPs)协助Dicer完成切割过程,并将产物转移到Argonaute蛋白。在这些辅助因子中,哺乳动物的TRBP/PACT和果蝇的R2D2/ Loqs已经得到了很好的研究。这些辅因子以化学计量比与Dicer结合,并影响其裂解活性、产物长度和产物传递等。所有的dsrbd都有一个共同的α -β -β -β - α-折叠,但根据它们与dsrna的结合能力,它们可以分为两类。Adsrbd具有类似的与序列无关的dsrna结合方式,而Bdsrbd没有dsrna结合活性20,21TRBP/PACTLoqs-PA/Loqs-PB分别有2AdsRBD1BdsRBD结合HsDicerDmDcr-1,分别为。R2D2Loqs异构体D (Loqs- pd)有两个Adsrbd,作为dmdcr -2的伴侣蛋白。

一般认为,DmDcr-2产生两种siRNA,一种是防御病毒的外siRNA,另一种是保护基因组完整性免受转座元件严重威胁的内siRNA(esiRNAs)。在dsRNA底物的切割过程中,DmDcr-2被观察到多种构象状态,包括易位状态、主动切割状态和切割后状态等。loq - pd的存在通过增加解旋酶域的初始dsrna结合率来增强DmDcr-2的加工活性。在dsRNA底物切割后,R2D2帮助DmDcr-2利用Hsp70/90伴体系统将产物siRNA双工引导到RNA干扰效应物Ago2中,而不是增强其切割活性。因此,R2D2RISC加载复合体(RLC)的重要组成部分。据报道,loq - pdR2D2siRNA途径中依次作用,并且它们是由外源性或内源性dsRNAs35触发的常见沉默。