MycoQSearch™ qPCR支原体检测试剂盒(EP)

中文名称：MycoQSearch™ qPCR支原体检测试剂盒(EP)

英文名称：MycoQsearch™ Mycoplasma qPCR Detection kit (EP)

一、产品原理：

MycoQSearch™支原体qPCR检测试剂盒采用探针法实时荧光PCR（qPCR），用于检测细胞培养物中的支原体污染。试剂盒包含引物探针混合液；FAM标记探针特异性识别支原体物种，HEX标记探针用于检测内对照DNA。

引物针对支原体基因组高度保守的16S rRNA编码区设计，可检出细胞培养常见污染支原体：口腔支原体、猪鼻支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体、人型支原体、肺炎支原体、唾液支原体、柠檬螺原体、滑液支原体以及脲原体。 本试剂盒不会扩增真核生物DNA以及其他细菌DNA。

二、产品特点：

1、用于生产细胞株与生物制品的支原体检测（符合欧洲药典EP、日本药典JP 、韩国食品药品安全部MFDS要求）； 

2、采用水解探针法实时荧光定量 PCR（qPCR）（FAM标记探针：支原体；HEX标记探针：内参IAC）；

3、高灵敏度：单反应 1~10拷贝靶DNA，实际样品灵敏度取决于核酸提取质量；

4、特异性：不检出与支原体亲缘关系相近的其他菌种；

5、UDG防污染体系：防止扩增产物交叉污染（携带污染）；

6、检测时长：视qPCR仪器，总检测可控制在3小时以内。

三、试剂盒主要组分：

四、标准实验流程要点（EP 2.6.7）

1、取1 mL细胞培养液，15000 rpm离心10 min，沉淀支原体，弃上清；

2、核酸提取（以Qiagen QIAamp UCP Pathogen Mini Kit为例）：加入蛋白酶K的同时，加入20μL紫色管IC内对照DNA，56℃裂解；后续按试剂盒完成提取，洗脱体积50μL；

3、qPCR总体系30μL；模板上样量5μL；

4、qPCR程序：

a.（选配UDG：增加37℃孵育步骤）

b.预变性：95 ℃，5 min

c.45循环：95 ℃ 20 sec；60 ℃ 30 sec；72 ℃ 30 sec

5、荧光采集：FAM（支原体）、HEX/VIC（内对照IC）

五、结果判读

六、ROX染料选型简表

1、High-ROX高ROX：ABI老机型：7000/7300/7900HT/StepOne系列

2、Low-ROX低ROX：ABI 7500、QuantStudio系列；Stratagene MX系列

3、No-ROX不加染料：Bio-Rad、Roche、Qiagen Rotor-Gene、Eppendorf等非ABI平台

七、关键注意点

1、反复冻融损伤试剂，频繁使用建议分装，-20℃保存；

2、推荐使用滤芯枪头，设置独立核酸配制区，降低气溶胶污染；

3、本试剂盒内对照为提取阶段加入的IC（提取内对照），同时有IAC扩增内参，可以同时监控提取损失与PCR抑制，

4、UDG酶为外购耗材，试剂盒不包含，不用UDG则无dUTPUNG防污染能力。

八、储运与有效期

运输与储存：-20℃    

有效期：详见外包装失效日期